单个细胞结构和细胞器官结构的电渗透方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种用于穿透包括单个细胞，细胞内结构或细胞器官的细胞结构的方法，包括下述步骤：（ａ）提供微电极，最好是两个碳纤维电极或中空的纤维电极；（ｂ）把微电极和电源相连；（ｃ）在适当的电极间距离的情况下，把由高分度微操作器单独控制的电极放置在细胞结构的附近；（ｄ）在电极之间施加强度足以实现电造孔的高度集中的电场。该方法可用于把不可透过细胞的溶质，例如药物或基因转移到细胞结构中，或者转移到细胞结构外，可用在生物传感器，可用于肿瘤和神经生成疾病的治疗，及生物物理过程的研究。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及渗透(permeabilisation)细胞结构、细胞器官结构和细胞状结构，以便把化合物输入或输出这些结构的高度立体清晰的方法。本专利技术还涉及该方法的应用。在过去的二十年内，可以供单细胞的生物化学和生物物理研究之用的实验方法得到了极大的发展。这些方法包括补片夹记录方法(patchclamp recording)，它可用于测量通过单离子通道的跨膜电流(O．P．Hamill，A．Marty，E．Neher，B．Sakman，F.J．Sigworth，PfleugersArch．391，85-100(1981))；可用于测定单细胞和单细胞器官中的生物活性成分位置的激光共焦显微成象技术(S．Maiti，J．B．Shear，R．M．Williams，W.R Zipfel，W．W．Webb，Science，275，530-532(1997))；用于细胞内部pH值测量的近场光学探头的应用；及用于测量含儿茶酚和吲哚-胺的单囊泡的释放的超微电极的应用(R．H．Chow，L．Von Ruden，E．Neher，Nature，356，60-63(1992)和R．M．Wightman，J．A．Jankowski，R．T．Kennedy，K．T．Kawagoe，T．J．Scroeder，D．J．Leszczyszyn，J．A．Near，E．J．Diliberto Jr．，O．H．Viveros，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A，88，10754-10758(1991))。虽然存在对单细胞和亚细胞细胞器官的内容进行检测、成象和分析的多种高分辨率技术，但是几乎不存在控制并操纵这些隔室的生物化学性质的方法。包括在细胞中的生物及医学应用的大多数化合物是极性的。极性溶质不能透过细胞，并且不能通过生物膜，除非存在特定的输送物。通常在实验生物学及在生物化学和临床工作中，必须把极性溶质引入细胞的细胞质中，或者引入细胞器官的内部。这种极性溶质的例子是纳米粒子，染料，药物，DNA，RNA，蛋白质，肽及氨基酸。目前，例如用染料标记细胞培养中的细胞，或者用基因转染(transfect)该细胞，而不标记或转染其相邻细胞是非常困难的。更为困难的是把极性分子引入细胞器官中，因为它们的尺寸往往小于光学显微镜的分辨率极限，或者直径上至少小于几个微米。另外还提出了用于单个细胞和单个细胞核的微观注射技术(例如参见M．R．Capecchi，Cell，22，479-488(1980))，但是随着细胞或细胞器官尺寸的减小，这些技术变得越来越难以实现。对于直径只有几微米或更小的细胞和细胞器官测量来说，微观注射技术实际上不可能得到应用。早已认识到脉冲电场可透过细胞膜(例如参见Zimmermann，U．Biochim．Biophys Acta，694，227-277(1982)；Tsong，T．Y． Biophys．J．，60，297-306(1991)；Weaver，J．C．J．Cell．Biochem．，51，426-435(1993))。该技术被称为电造孔(electroporation)。可根据下式计算持续时间t内，暴露在均匀电场中的磷脂双层球体上不同位置处的膜电压VmVm=1．5rcEcosα ( 1 )其中E是电场强度，rc是细胞半径，α是相对于电场方向的角度，τ是阻容时间常数。小孔的形成将导致暴露于最大电位偏移的球坐标系，最大电位偏移位于面对电极的两极(α=0，则cosα=1；α=π，则cosα=-1)。通常，持续时间几微秒至几毫秒，数量级为1-1．5kV／cm的电场强度足以在外径10微米的球形细胞中引起瞬态透过。最近的研究表明独立的线粒体，由于其相应更小的尺寸，需要7-10倍更高的电场强度，以便注入7．2-千基(kilobase)质粒DNA(J-M．Collombet，V．C．Wheeler，F.Vogel，＆C．Coutelle J．Biol．Chem．，272，5342-5347(1997))。还观察到在约2．5kV／cm的较低电场强度下的线粒体外膜融合。通常，以分批方式实现电造孔，便于把极性溶质同时引入几百万个细胞中。产生这种电场的电极可为几个平方厘米，并且电极之间的距离为几个厘米，从而为了获得引起生物膜的电诱发渗透的所需电场强度，需要高电压电源。和微观注射技术相比，电造孔的一个优点是电造孔可以非常快，并可被精确计时(例如参见K．Kinosita，K．，Jr．，I．Ashikawa，N．Saita，H．Yoshimura，H．Itoh，K．Nagayama，＆A．IkegamiJ．Biophys．，53，1015-1019(1988)；M．Hibino，M．Shigemori，H．Itoh，K．Nagayama，＆K．Ki-nosita，K．，Jr．，Biophys．J．，59，209-220(1991))，这在研究快速反应现象方面非常重要。K．Kinosita，Jr．，＆T．Y．Tsong，T．Biochim．Biophys．Acta，554，479-497(1979)；D．C Chang，J．Biophys．，56，641-652(1989)；P．E．Marszalek，B．Farrel，P.Verdugo，＆J．M．Fernandez，Biophys．J．，73，1160-1168(1997)中说明了可用于悬浮液中的少量细胞的电造孔的仪器，Q．A．Zheng，＆D．C．Chang，Biochim．Biophys．Acta，1088，104-110(1991)；M．N．Teruel，＆T．Meyer Biophys．J．，73，1785-1796(1997)中说明了可用于在培养基上生长的少量粘附细胞的电造孔的仪器。由Marszalek等构造的电造孔装置的设计基于以100微米的固定距离并行粘结在单个玻璃微量吸移管上的直径80微米，长6毫米的铂丝。Kinosita和Tsong的设计使用间隔2毫米的间隙距离的固定黄铜电极，Teruel和Meyer的微造孔器(microporator)设计取决于间隔约5毫米的间隙距离的两个铂电极，Chang设计的电造孔室使用间距0．4毫米的约1毫米长的铂丝。显然，这些电造孔装置产生比单个细胞的尺寸大几个数量级的电场，单个细胞的直径一般为10微米，从而这些电场不能用于单个细胞或单个细胞器官的专用电造孔，或者用于在单个细胞内的电造孔。另外还设计了用于临床应用的电造孔装置。例子包括通过电造孔向肿瘤输送药物和基因的装置(WO96／39226)，和通过电造孔向血细胞输送药物和基因的装置(US专利5501662)。同样，这些装置不能用于产生用于单个细胞，单个细胞器官，或者细胞内的细胞器官群的电造孔的高度定域电场。已知技术的一个主要缺点是它们不适用于单个细胞或者单个细胞内器官的穿透。本专利技术提供一种基于凭借脉冲电场的磷脂双层膜的穿透，即所谓的电造孔，改变单个细胞和细胞器官的生物化学内容的高度立体清晰的技术。和已知的电造孔方法相比，根据本专利技术的方法的一个优点是根据本专利技术的方法的特征在于由高度集中的穿透电场确定的极高的空间分辨率。通过利用外径在几纳米到几微米范围内的一对电造孔电极，获得这种高度集本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于穿透包括单个细胞，细胞内结构或细胞器官的细胞结构的方法，其特征在于包括下述步骤：（ａ）提供微电极；（ｂ）把微电极和电源相连；（ｃ）以适当的电极间距离，把由高分度微操作器单独控制的电极放置在细胞结构的附近；（ｄ）在电极 之间施加强度足以实现电造孔的高度集中的电场。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：乌韦奥尔瓦尔，安德斯伦德奎斯特，比德埃里克森，丹尼尔邱，
申请(专利权)人：塞勒克特里康股份公司，
类型：发明
国别省市：SE[瑞典]