本发明专利技术提供了PD‑1基因沉默的靶向CD133的CAR T细胞及其应用。所述的PD‑1基因沉默的靶向CD133的CAR T细胞，其特征在于，其制备方法包括：首先利用核转染系统将CRISPR‑Cas9和转座子系统同时导入PBMC中，然后激活T细胞，进行T细胞扩增，得到PD‑1基因沉默的靶向CD133的CAR T细胞。本发明专利技术提供的PD‑1基因沉默的靶向CD133的CAR T细胞可解决PD‑1通路介导的免疫抑制，预防肿瘤转移和复发。而相比基于PD‑1或PD‑L1抗体的联合治疗，PD‑1基因沉默的靶向CD133的CAR T细胞可有效避免系统性毒性问题，精准调节免疫微环境。
【技术实现步骤摘要】
PD-1基因沉默的靶向CD133的CART细胞及其应用
本专利技术属于肿瘤的免疫细胞治疗领域，具体涉及一种PD-1基因沉默的靶向CD133的CART细胞及其应用。
技术介绍
肿瘤干细胞假说认为肿瘤中存在一小群细胞，其具备自我增殖、启动肿瘤发生和分化为其他肿瘤细胞的能力。大量的实验数据也揭示了这一群细胞的存在。更重要的是，研究表明肿瘤干细胞具有抗药性，与化疗、放疗等传统治疗的失败相关，是导致肿瘤转移和复发的重要因素。因此靶向肿瘤干细胞将是肿瘤治疗成功的关键[1]。CD133是目前最常用的识别肿瘤干细胞的分子标记物之一，在多种实体瘤中均表达，包括脑胶质瘤、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌及卵巢癌等，因此可以通过识别CD133靶向杀伤相关肿瘤干细胞[2]。已报道的靶向CD133阳性细胞的方法包括抗CD133的免疫毒素[3，4]、双特异抗体[5，6]等，均显示了一定应用前景。另外，靶向肿瘤干细胞靶点CD133的嵌合抗原受体(CAR)修饰T细胞可以特异性杀伤脑胶质瘤干细胞，为CART细胞靶向治疗肿瘤奠定了基础[7]。肿瘤特异性嵌合抗原受体(CAR)是由识别肿瘤细胞表面抗原的结合区与多个T细胞信号区融合构成的重组分子，其中结合区通常为单链抗体可变区或者抗原的天然配体，而信号区则来自于T细胞受体复合物和共刺激受体的胞内部分[8]。因此，表达嵌合抗原受体的T细胞(CART)可以通过识别肿瘤细胞引起T细胞激活，进而杀伤肿瘤细胞[9，10]。CART细胞治疗已经在CD19阳性的血液恶性肿瘤中显示非常好的疗效[11]。但是CART细胞治疗实体瘤的效果仍然有限。CART细胞在实体肿瘤的治疗中面临的挑战主要包括：缺乏肿瘤特异性的抗原，从而存在攻击正常细胞引起严重副反应的风险；T细胞难以有效地到达肿瘤部位；肿瘤微环境常常是免疫抑制的，使得T细胞失去功能和凋亡[12]。在肿瘤免疫应答中，肿瘤抗原特异性T细胞的诱导凋亡和无反应性是肿瘤细胞免疫逃逸中的主要机制，而程序性死亡分子1(Programmeddeath1，PD-1)/程序性死亡分子配体1(Programmeddeath-ligand1，PD-L1)信号正是许多肿瘤细胞实现免疫逃逸的重要途径。主要机制是通过T细胞的PD-1蛋白与肿瘤细胞表面的PD-L1结合，导致PD-1通路持续激活，T细胞功能被抑制，以至于不能攻击和杀伤肿瘤细胞[13]。目前应用于临床研究的PD-1或者PD-L1抗体，通过阻断PD-1/PD-L1通路，部分恢复T细胞的功能，使其能够继续杀伤肿瘤细胞，具有治疗多种类型肿瘤的潜力。在黑素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、恶性血液病和非小细胞肺癌等均显示良好的临床疗效[14]，以至于PD-1或PD-L1抗体药物在多个国家均获得批准上市。研究显示CD133-CART细胞在动物模型中仅仅具备短时间的抑制肿瘤生长能力[7]，推测CART细胞在体内执行功能时亦受到PD-1/PD-L1通路免疫抑制。事实上，John等的研究表明，在小鼠中联用PD-1抗体和CART细胞可以显著增强CART细胞的抑制肿瘤功能[15]，一定程度上揭示了PD-1/PD-L1通路对CART细胞功能的影响。然而利用免疫检查点阻断抗体进行免疫治疗至少存在2个问题：1、免疫检查点阻断抗体在治疗肿瘤的同时也会打破机体正常的免疫耐受，使得机体正常组织和器官受到活化的T细胞攻击，长期使用会存在系统性毒性[16]；2、免疫检查点包含多个成员，仅仅阻断PD-1/PD-L1通路可能是不够的。最近Koyama等的研究表明，肿瘤对PD-1抗体治疗的耐受跟其他的检查点分子的上调相关，比如T细胞免疫球蛋白与黏蛋白域蛋白3(T-cellimmunoglobulinmucin-3，TIM-3)[17]。而开发多组高效的抗体需要较长的时间和投入，因此联合使用多个抗体的研发难度大。任何一种阻断免疫检查点的方式，都可能达到同样的治疗效果。可编程核酸内切酶技术，包括锌指核酸酶(zinc-fingernucleases，ZFNs)技术和转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectorsnucleases，TALENs)技术，以及规律成簇间隔短回文重复系统(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat；CRISPR-associated，CRISPR-Cas9)，可以识别特定的DNA序列，并进行切割造成双链DNA断裂，在没有模板的条件下，发生非同源末端连接修复，造成移码突变导致基因敲除[18]，因而为免疫检查点基因操作提供了很好的工具。参考文献1.Pattabiraman，D.R.andR.A.Weinberg，Tacklingthecancerstemcells-whatchallengesdotheypose？NatRevDrugDiscov，2014.13(7)：p.497-512.2.Grosse-Gehling，P.，etal.，CD133asabiomarkerforputativecancerstemcellsinsolidtumours：limitations，problemsandchallenges.JPathol，2013.229(3)：p.355-78.3.Bostad，M.，etal.，Light-controlledendosomalescapeofthenovelCD133-targetingimmunotoxinAC133-saporinbyphotochemicalinternalization-Aminimallyinvasivecancerstemcell-targetingstrategy.JControlRelease，2015.206：p.37-48.4.Ohlfest，J.R.，etal.，ImmunotoxintargetingCD133(+)breastcarcinomacells.DrugDelivTranslRes，2013.3(2)：p.195-204.5.Prasad，S.，etal.，EffectiveEradicationofGlioblastomaStemCellsbyLocalApplicationofanAC133/CD133-SpecificT-cell-EngagingAntibodyandCD8TCells.CancerRes，2015.75(11)：p.2166-76.6.Zhao，L.，etal.，TargetingCD133highColorectalCancerCellsInVitroandInVivoWithanAsymmetricBispecificAntibody.JImmunother，2015.38(6)：p.217-28.7.Zhu，X.，etal.，Patient-derivedglioblastomastemcellsarekilledbyCD133-specificCARTcellsbutinducetheTcellagingmarkerCD57.Oncotarget，2015.6(1)：p.171-84.8.Sadelain，M.，R.Br本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种PD‑1基因沉默的靶向CD133的CAR T细胞，其特征在于，通过将CRISPR‑Cas9和piggyBac转座子系统同时导入PBMC中敲除靶向CD133的CAR T细胞中的PD‑1基因获得。
【技术特征摘要】
1.一种PD-1基因沉默的靶向CD133的CART细胞，其特征在于，通过将CRISPR-Cas9和piggyBac转座子系统同时导入PBMC中敲除靶向CD133的CART细胞中的PD-1基因获得。2.权利要求1所述的PD-1基因沉默的靶向CD133的CART细胞的制备方法，其特征在于，包括：首先利用核转染系统将CRISPR-Cas9和piggyBac转座子系统同时导入PBMC中敲除靶向CD133的CART细胞中的PD-1基因，然后激活T细胞，进行T细胞扩增，得到PD-1基因沉默的靶向CD133的CART细胞。3.如权利要求2所述的PD-1基因沉默的靶向CD133的CART细胞的制备方法，其特征在于，所述的CRISPR-Cas9和piggyBac转座子系统包含质粒pGL3-U6-hPD1-sgRNA(1+2)、pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF、AC133-CARpiggyBactransposon和SuperpiggyBactransposase。4.如权利要求2所述的PD-1基因沉默的靶向CD133的CART细胞的制备方法，其特征在于，所述的激活T细胞使用可溶性CD3...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱学锴，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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