一种将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的方法及其应用。本方法利用SalI单酶将pRK5‑Sufu‑GFP表达载体进行酶切，再利用连接酶将NLS连接到载体内，之后经转化得到插入NLS数量不等的核定位载体pRK5‑Sufu‑nNLS‑GFP(SnNG)，最后将胞浆蛋白成功定位于细胞核内。本发明专利技术方法可以一次性插入多条NLS，同时获得插入n种质粒载体(n为1‑5)，能够将外源性胞浆蛋白高效定位于细胞核内的。实现通过一次性构建带有1～5个NLS的胞浆蛋白，转染这种质粒到小鼠成纤维细胞(MEFs)中，研究这种胞浆蛋白在胞浆/胞核的定位与其在细胞中的生物学活性和功能的量效关系。

A method for the efficient localization of exogenous mammalian cytoplasmic protein in the nucleus and its application

The present invention discloses a method for efficiently locating the exogenous mammalian cytoplasmic protein in the nucleus and its application. This method uses SalI pRK5 Sufu single enzyme GFP expression vector were digested by ligase NLS connected to the carrier, after the transformation into the NLS get varying amounts of nuclear localization vector pRK5 Sufu nNLS GFP (SnNG), the cytosolic protein was successfully localized in the nucleus. The method of the invention can be disposable into multiple NLS, inserted into n plasmid vector and obtained (n 1, 5) to exogenous cytoplasmic protein, is localized in the nucleus. We constructed a cytoplasmic protein with 1~5 NLS and transfected the plasmid into mouse fibroblast (MEFs). We studied the location of cytoplasmic protein in cytoplasm / nucleus and its dose effect relationship in cell biological activity and function.

【技术实现步骤摘要】
一种将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的方法及其应用
本专利技术属于生命科学领域，具体涉及一种将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的方法及其应用。
技术介绍
蛋白质在细胞中的定位对于蛋白发挥其功能具有重要意义，一旦发生错误的定位，将会对正常细胞的活动产生不可逆的恶果，例如发育的缺陷和肿瘤的产生。一些蛋白由于含有核定位序列信号(nuclearlocalizationsignal，NLS)，通过与核输入蛋白importin结合，继而发生一系列反应，进入到细胞核内发挥其相应的功能，如转录促进因子和转录抑制因子。但是仍然有很多并不具有NLS的蛋白能够定位于细胞核内，可能依赖的其他途径，如分子伴侣等。因此，研究蛋白质在细胞核中的定位及其定位后发挥的功能至关重要。将外源性细胞浆定位的蛋白人工定位于细胞核中，现有的方法是利用分子克隆的手段导入核定位序列信号NLS。然而，目前只能一次导入1-2条核定位序列信号，不能满足同时导入多条，因此，量效关系无法获得，导致后期实验结果的不准确。在质粒构建时一般采取的是双酶切的方法，现有的技术在质粒构建时，一般采用的是双酶切的方法，是将NLS两端设计双酶切位点，同时在载体上进行双酶切，一次只能插入一段NLS，既不方便也达不到插入多条的要求。或者在体外直接合成一条或者多条NLS，但是这种方法一般最多合成两条即54个碱基，太长了会增加成本。本专利技术方法中NLS在与表达载体进行连接的时候，小片段的NLS可以利用单酶(SalI)进行酶切所导致的粘性末端进行自连，且连接的数量随机不等，之后再与酶切过的载体粘性末端进行连接，故而产生数量不等的NLS载体。因此本专利技术方法可以一次性插入多条NLS，也可以达到同时获得插入1～n条NLS的多种质粒载体(n为1～5)。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的方法及其应用。以期实现通过一次性构建带有1～5个核定位序列信号(NLS)的胞浆蛋白，转染这种质粒到Sufu基因敲除的小鼠成纤维细胞(Sufu-/-MEFs)中，研究这种胞浆蛋白在胞浆/胞核的定位与其在细胞中的生物学活性和功能的量效关系。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的方法，包括以下步骤：(1)构建pRK5-Sufu-GFP表达载体：在pRK5载体(图1)的多克隆位点SalI和HindIII之间插入绿色荧光蛋白GFP，即成为pRK5-GFP表达载体，再在ClaI和SalI之间插入一个胞浆蛋白Sufu的cDNA序列，即构建为pRK5-Sufu-GFP表达载体；(2)外源性合成带有粘性末端的双链核定位序列信号(NLS)：使用来自大T抗原的核定位序列信号肽PKKKRKV，首先合成带有单酶切位点SalI(GTCGAC)的两条单链NLS序列，利用退火将两条单链合成为一条双链，即得到带有粘性末端的双链核定位序列信号；(3)构建插入NLS数量不等的核定位载体(pRK5-Sufu-nNLS-GFP，简写为SnNG)：利用分子克隆技术，将NLS序列连接至pRK5-Sufu-GFP的Sufu和GFP中间的SalI酶切位点处，利用SalI单酶将pRK5-Sufu-GFP表达载体进行酶切，再利用连接酶将NLS连接到载体内，之后进行转化、涂板，第二天长出单克隆之后进行菌落PCR，跑PAGE胶，观察插入片段大小，插入片段比阴性对照多27n个碱基(27为一个NLS的碱基数，n≥1，n为整数)，挑出所有阳性克隆，进行测序，即得到插入NLS数量不等的核定位载体(pRK5-Sufu-nNLS-GFP，简写为SnNG)；(4)观察胞浆蛋白核定位情况：将核定位载体pRK5-Sufu-nNLS-GFP转染至Sufu基因敲除的小鼠成纤维(Sufu-/-MEFs)细胞内，使用DAPI染细胞核，之后利用荧光显微镜观察核定位载体pRK5-Sufu-nNLS-GFP在细胞中的定位情况，并进行统计分析。上述核定位载体pRK5-Sufu-nNLS-GFP的应用，包括：(1)核定位载体pRK5-Sufu-nNLS-GFP在将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的应用；(2)利用荧光素酶报告基因系统检测载体pRK5-Sufu-nNLS-GFP对Gli1转录活性的调控；(3)利用荧光定量PCR方法检测载体pRK5-Sufu-nNLS-GFP对Hedgehog信号通路下游靶基因gli1和ptch1的mRNA表达水平影响，获得插入数量不等的NLS的pRK5-Sufu-GFP对Hedgehog信号通路活性调节的量效关系。优选的，步骤(2)所述NLS的序列为：正向：5-“GTCGACCCGAAGAAGAAGCGTAAGGTC”-3，如SEQIDNO.1所示；反向：5-“CAGCTGGACCTTACGCTTCTTCTTCGG”-3，如SEQIDNO.2所示。本专利技术的有益效果：本专利技术方法中NLS在与表达载体进行连接的时候，小片段的NLS可以利用单酶(SalI)切所导致的粘性末端进行自连，且连接的数量随机不等，之后再与酶切过的载体的粘性末端进行连接，故而产生数量不等的NLS载体。因此本专利技术方法可以一次性插入多条NLS，达到同时获得插入1～5条NLS的多种质粒载体。本专利技术方法可以实现通过一次性构建带有1～5个核定位序列信号(NLS)的胞浆蛋白，转染这种质粒到小鼠成纤维细胞(MEFs)中，研究这种胞浆蛋白在胞浆/胞核的定位与其在细胞中的生物学活性和功能的量效关系。附图说明图1是pRK5质粒载体图谱；图2a为NLS插入数量不等的Sufu-GFP载体基因片段示意图；图2b为NLS插入数量不等的Sufu-GFP(即SnNG)在Sufu基因敲除的小鼠成纤维细胞系(Sufu-/-MEFs)中的定位情况；图3a是S5NG对Hedgehog信号通路下游靶基因gli1mRNA表达的影响；图3b是S5NG对Hedgehog信号通路下游靶基因ptch1mRNA表达的影响；图4是不同质粒对蛋白Gli1转录活性的影响。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。以下实施例所使用的仪器设备为：ChemiDOCXRS凝胶成像系统(Bio-Rad公司，美国)；7500型荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems公司，美国)；IX-71型荧光倒置显微镜(Olympus公司，日本)；伯乐垂直电泳系统(Bio-Rad公司，美国)SmartSpecPlus核酸蛋白测定仪(Bio-Rad公司，美国)；其他未列出的设备为常用设备。以下实施例所使用的细胞及试剂为：小鼠成纤维细胞系(MEFs)和pRK5-Sufu-GFP质粒由南京医科大学程雁教授实验室馈赠；DMEM细胞培养基(InvitrogenLifeTechnologies公司，美国)和小牛血清购自GIBCO公司；NLS序列和菌落PCR序列合成由金思瑞(南京，中国)完成；SalI限制性内切酶购置于NewEnglandBiolabs公司(美国)；DNAT4连接酶、RNA逆转录试剂盒和荧光定量PCR反应Mix购置于大连宝生物公司(中国)；DAPI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建pRK5‑Sufu‑GFP表达载体：在pRK5载体的多克隆位点SalI和HindIII之间插入绿色荧光蛋白GFP，即成为pRK5‑GFP表达载体，再在ClaI和SalI之间插入一个胞浆蛋白Sufu的cDNA序列，即构建为pRK5‑Sufu‑GFP表达载体；(2)外源性合成带有粘性末端的双链核定位序列信号(NLS)：使用来自大T抗原的核定位序列信号肽PKKKRKV，首先合成带有单酶切位点SalI(GTCGAC)的两条单链NLS序列，利用退火将两条单链合成为一条双链，即得到带有粘性末端的双链核定位序列信号；(3)构建插入NLS数量不等的核定位载体pRK5‑Sufu‑nNLS‑GFP，简写为SnNG：利用分子克隆技术，将NLS序列连接至pRK5‑Sufu‑GFP的Sufu和GFP中间的SalI酶切位点处，利用SalI单酶将pRK5‑Sufu‑GFP表达载体进行酶切，再利用连接酶将NLS连接到载体内，之后进行转化、涂板，第二天长出单克隆之后进行菌落PCR，跑PAGE胶，观察插入片段大小，插入片段比阴性对照多27n个碱基，27为一个NLS的碱基数，n为≥1的整数，挑出所有阳性克隆，进行测序，得到插入NLS数量不等的核定位载体pRK5‑Sufu‑nNLS‑GFP，简写为SnNG；(4)观察胞浆蛋白核定位情况：将核定位载体pRK5‑Sufu‑nNLS‑GFP转染至Sufu基因敲除的小鼠成纤维(Sufu‑/‑MEFs)细胞内，使用DAPI染细胞核，之后利用荧光显微镜观察核定位载体pRK5‑Sufu‑nNLS‑GFP在细胞中的定位情况，并进行统计分析。...

【技术特征摘要】
1.一种将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建pRK5-Sufu-GFP表达载体：在pRK5载体的多克隆位点SalI和HindIII之间插入绿色荧光蛋白GFP，即成为pRK5-GFP表达载体，再在ClaI和SalI之间插入一个胞浆蛋白Sufu的cDNA序列，即构建为pRK5-Sufu-GFP表达载体；(2)外源性合成带有粘性末端的双链核定位序列信号(NLS)：使用来自大T抗原的核定位序列信号肽PKKKRKV，首先合成带有单酶切位点SalI(GTCGAC)的两条单链NLS序列，利用退火将两条单链合成为一条双链，即得到带有粘性末端的双链核定位序列信号；(3)构建插入NLS数量不等的核定位载体pRK5-Sufu-nNLS-GFP，简写为SnNG：利用分子克隆技术，将NLS序列连接至pRK5-Sufu-GFP的Sufu和GFP中间的SalI酶切位点处，利用SalI单酶将pRK5-Sufu-GFP表达载体进行酶切，再利用连接酶将NLS连接到载体内，之后进行转化、涂板，第二天长出单克隆之后进行菌落PCR，跑PAGE胶，观察插入片段大小，插入片段比阴性对照多27n个碱基，27为一个NLS的碱基数，n为≥1的整数，挑出所有阳性克隆，进行测序，得到插入NLS数量不等的核定位载...

【专利技术属性】
技术研发人员：张子宇，邹阳，杨必成，刘发英，罗勇，
申请(专利权)人：江西省妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：江西,36