一种草酸青霉菌剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种草酸青霉菌菌剂的制备方法，包括种子培育、扩大培养、液膜萃取，制备菌剂。该草酸青霉菌菌剂可通过单一菌株防治多种果蔬病害，对猕猴桃溃疡病、细菌性穿孔病、苹果轮纹病、马铃薯干腐病和桃褐腐病等多种果蔬病害的抑菌率达90％以上，抗菌谱广，可有效降低防治成本。

A kind of Penicillium oxalic agent and its preparation and Application

The invention provides a preparation method of Penicillium oxalicum, including seed cultivation, expanded culture, liquid membrane extraction, and preparation of bactericide. The agent of Penicillium oxalicum by single strain control a variety of fruit and vegetable diseases, inhibition of kiwifruit bacterial canker disease, perforation, apple rot, potato dry rot and brown rot of peach and other fruit and vegetable diseases rate reached more than 90%, wide antibacterial spectrum, can effectively reduce the control cost.

【技术实现步骤摘要】
一种草酸青霉菌剂及其制备方法和应用
本专利技术涉及微生物领域，尤其涉及一种草酸青霉菌剂及其制备方法和在防治果蔬主要病害中的应用。
技术介绍
桃褐腐病、细菌性穿孔病、猕猴桃溃疡病、苹果轮纹病等植物病原真菌对农作物危害严重，防治难度大。目前化学农药是预防和治疗植物病害的有效手段，在保障农作物高产和稳产方面发挥了巨大的作用。但传统化学农药的长期大量不合理使用所造成残留、抗性和再猖獗，引起社会的普遍关注。寻求和开发对人类健康及生态安全的新型农药越来越迫切。液膜萃取法兼有溶剂萃取和膜渗透两项技术特点，按其结构可分为乳化液膜(emulsionliquidmembrane)和支撑液膜(supportedliquidmembrane)两大类。乳化液膜为液体表面活性剂形成的球面，将溶液分为内相和外相，液膜只有几个分子厚，单位体积的表面积可达1000-3000m2/m3，具有萃取速度快、分离与浓缩一步完成、能从低浓度溶液中有效回收溶质等优点，但液膜的稳定性问题较难解决。支撑液膜是将起分离作用的液相借助毛细作用固定在多孔高分子膜中。支撑液膜可使萃取与反萃取在液膜的两侧同时进行，从而避免载体负荷的限制、减少有机相的使用量，解决了乳化液膜的乳化液稳定条件及破乳等问题。本专利技术采用支撑液膜。在植物病害的生物防治中研究和应用较多的微生物主要有细菌类、真菌类和放线菌。真菌主要有木霉菌(Trichoderma)(如哈茨木霉(T.harzianum)、康氏木霉(T.koningii)、绿色木霉(T.viride)等)、青霉、丝核菌、酵母菌、粘帚霉、盾壳霉等。有研究报道从桃枝分离的penicilliumpurpurogenum对桃褐腐病原菌有很好防效；淡紫拟青霉对南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、孢囊线虫(Heteridera)、白色球包囊线虫(Globoderpallida)、穿刺线虫(Tylenchulus)、金色线虫、异皮线虫和珍珠线虫(Nacobbus)有很强的寄生能力，通过提高植物自身抗病能力来抑菌(JatalaP.Biologicalcontrolofplant-parasiticnematodes[J].AnnRevPhytopathol,1986,24:452-489)；申光辉等筛选到灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)和土曲霉(Aspergillusterreus)两种拮抗真菌对草莓根腐病有较强的拮抗作用(申光辉，薛泉宏，张晶等，草莓根腐病拮抗真菌筛选鉴定及其防病促生作用[J].中国农业科学，2012(22)：4612-4626)；王国平等从南方红豆杉分离出一种新内真菌紫杉木霉菌株，用于治疗水稻纹枯病(王国平，鲁书玲，郑必强等.内生真菌紫杉木霉ZJUF0986菌株及其活性代谢产物防治水稻纹枯病的效果[J].中国生物治2009(01)：30-34)；同时也有生物农药草酸青霉水剂对玉米小斑病的防治研究(王勇，张文革，何璐等.生物农药草酸青霉水剂对玉米小斑病的防治效果[J].安徽农业科学，2007，35(7)：1965-1966)，草酸青霉对大豆胞囊线虫的防治也有报道。(李婷，黄文坤，彭德良等。3种防真菌发酵液对大豆包囊线虫的防治效果[J].华中农业大学学报，2017，01(007)：42-46)。然而，关于草酸青霉在果蔬主要病害猕猴桃溃疡病、细菌性穿孔病、苹果轮纹病、桃褐腐病上的防治研究及应用未见报道。松花粉为松科植物马尾松PinusmassonianaLamb.、油松PinustabuliformisCarr.或同属数种植物的干燥花粉，含有丰富的蛋白质、类脂、氨基酸、多种微量元素、维生素、酶、色素及抗菌素等，以松花粉为营养培养草酸青霉菌增强杀菌能力的研究未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种草酸青霉菌菌剂的制备方法，该方法通过种子培养、扩大培养、液膜萃取获得可具有防治果蔬主要病害的草酸青霉菌菌剂。本专利技术的另一目的在于提供一种采用上述方法制备的草酸青霉菌菌剂。本专利技术的第三个目的在于提供上述草酸青霉菌菌剂的应用。为了实现上述目的，本专利技术提供一种草酸青霉菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)种子培养：将草酸青霉菌接种到加味PDA液体培养基，25-28℃摇床180r/min培养7d得到草酸青霉菌培养液；2)按10％接种量将步骤1)培养的草酸青霉菌培养液接种到加味PDA液体培养基，25-28℃摇床180r/min培养24h制成草酸青霉悬浮液；3)扩大培养：将草酸青霉悬浮液按体积比1：25～30接种到生产罐培养基中，通气量2L/min，25-28℃发酵罐200r/min发酵72h获得发酵液；4)在发酵液中加入2％的200目天花粉，吸附15-30min，然后用纱布过滤，滤过菌丝和孢子及其他不溶物，得发酵预处理液；本步骤中天花粉对发酵液进行一个初步吸附，主要吸附杂质，经纱布过滤时天花粉吸附的成分会被纱布过滤除掉。5)液膜萃取：将发酵预处理液用双蒸水稀释U＝500mg/L，体系采用Celgard-2500-30％TFA液膜，pH＝6-8(优选pH＝7)、30℃、转速400-500r/min，温度28±3℃，添加Na2CO3溶液至终浓度为15％Na2CO3，得萃取液。Celgard-2500-30％TFA液膜是在Celgard-2500两面涂覆30％TFA(三氟乙酸)制成。其中，所述加味PDA液体培养基配方为：去皮土豆200g、葡萄糖20g、松花粉20g、维生素C0.5g、用蒸馏水定容到1000mL。灭菌时将加味PDA液体培养基中除维生素C以外的成分110-121℃灭菌25min，冷却至室温，维生素C过滤灭菌后加入到培养基中即可。加味PDA液体培养基在现有PDA培养基基础上增加了松花粉和维生素C，其中松花粉是松树花蕊的精细胞，含多种蛋白质、氨基酸、矿物质、酶与辅酶、核酸、单糖、多糖等200余种营养成份，且具有抗菌效果，为草酸青霉菌提供生长所需营养，维生素C促进草酸青霉的生长。其中，所述生产罐培养基配方为：玉米面1500g、40目玉米秸秆粉12000g、松花粉620g、K2HPO4600g、FeSO41.5g、加水至30000mL，121℃灭菌30min。在扩大培养的培养基中添加松花粉，其中松花粉具有抗菌效果，同时为草酸青霉菌提供生长所需营养。其中，所述草酸青霉菌菌剂加入辅料制成喷雾剂、烟雾剂、水剂、乳化剂、可湿性粉剂、粉剂、颗粒剂、片剂或泡腾剂。本专利技术还提供上述制备方法制备的草酸青霉菌菌剂。本专利技术还提供上述草酸青霉菌菌剂在抑制桃褐腐、细菌性穿孔病、苹果轮纹病、马铃薯干腐病、猕猴桃溃疡病中的应用。草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)，该菌分生孢子梗直立，高度为100-200μm、无色、有分隔、具有刷状小梗、小梗丛生于分支顶端呈花束状、分生孢子呈链状生长、球形至椭圆形、无色至着色、光滑，大4.5-6.5×3.0-4.0μm；菌落先呈散点状,生长后成片；菌落边缘淡白色、不光滑，孢子形成后淡黄绿至墨绿色。草酸青霉菌以含松花粉的培养基发酵，发酵液采用液膜萃取处理，制备具防治桃褐腐病、细菌性穿孔病、苹果轮纹病、马铃薯干腐病、猕猴桃溃疡病的杀菌剂。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种草酸青霉菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)种子培养：将草酸青霉菌接种到加味PDA液体培养基，25‑28℃摇床180r/min培养7d得到草酸青霉菌培养液；2)按10％接种量将步骤1)培养的草酸青霉菌培养液接种到加味PDA液体培养基，25‑28℃摇床180r/min培养24h制成草酸青霉悬浮液；3)扩大培养：将草酸青霉悬浮液按体积比1：25～30接种到生产罐培养基中，通气量2L/min，25‑28℃发酵罐200r/min发酵72h获得发酵液；4)在发酵液中加入2％的200目天花粉吸附15‑30min，然后用纱布过滤，得发酵预处理液；5)液膜萃取：将发酵预处理液用双蒸水稀释U＝500mg/L，体系采用Celgard‑2500‑30％TFA液膜，pH＝6‑8、30℃、转速400‑500r/min，温度28±3℃，添加Na2CO3溶液至终浓度为15％Na2CO3，得萃取液。

【技术特征摘要】
1.一种草酸青霉菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)种子培养：将草酸青霉菌接种到加味PDA液体培养基，25-28℃摇床180r/min培养7d得到草酸青霉菌培养液；2)按10％接种量将步骤1)培养的草酸青霉菌培养液接种到加味PDA液体培养基，25-28℃摇床180r/min培养24h制成草酸青霉悬浮液；3)扩大培养：将草酸青霉悬浮液按体积比1：25～30接种到生产罐培养基中，通气量2L/min，25-28℃发酵罐200r/min发酵72h获得发酵液；4)在发酵液中加入2％的200目天花粉吸附15-30min，然后用纱布过滤，得发酵预处理液；5)液膜萃取：将发酵预处理液用双蒸水稀释U＝500mg/L，体系采用Celgard-2500-30％TFA液膜，pH＝6-8、30℃、转速400-500r/min，温度28±3℃，添加Na2CO3溶液至终浓度为15％Na2CO3，得萃取液。2.如权利要求1所述草酸青霉菌菌剂的制备方法，其特征在于，进一步包括：步骤7)按萃取液：50％氢氧化钠＝1：1混合，搅拌，加热至35-50℃，反应1h，调pH值6-8，过滤除去杂质和不溶物。3.如权利要求1或2所述草酸青霉菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述加味PDA液体培养基配方为：去皮土豆200g、葡萄糖20g、松花粉20g、维生素C0.5g、用蒸馏水定容到1...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛喜珍，李朋钰，杨涛，李映，田平芳，
申请(专利权)人：北京联合大学，
类型：发明
国别省市：北京,11