共价寡聚的膜破裂性肽制造技术

本发明专利技术涉及经修饰的膜破裂性肽。本发明专利技术还涉及含有所述经修饰的膜破裂性肽的传递复合物和该传递复合物的应用。所述经修饰的膜破裂性肽被修饰成共价连接的多聚体。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及经修饰的膜破裂性肽。本专利技术还涉及含有所述经修饰的膜破裂性肽的传递复合物和该传递复合物的应用。在基因治疗的领域中需要可以用来有效转染细胞的简单非病毒基因传递剂。阳离子型肽通过静电作用与DNA缩合并且已被用于制备简单和可复制的肽DNA制剂。其制备和提纯方法业已被广泛报导。阳离子型肽还被作为化学锚用于其他肽类或非肽类实体的引入，以协助经包装的基因从细胞外位置向预期靶细胞核的通过。数组科研人员证实，当采用阳离子型肽作为体外传递剂时，只有在被认为通过提高基因进行转运从而脱离胞内囊泡的能力而起作用的外源性试剂的存在下转染才是最理想的，所述囊泡在细胞摄取过程中或摄取后包封基因。外源性试剂的实例是氯喹或膜破裂性肽。可以确信生物膜的去稳定化是这些试剂作用的核心。任何对于传递复合物的通过来说成为屏障的膜的结构的破裂将增强其到达核的能力。然而，有理由假设对于许多体内应用而言，除使制剂复杂化之外，外源性试剂如小有机分子氯喹的使用将受到小分子和大分子之间建立的不同的体内清除机制以及扩散速率的阻碍。融合或膜破裂性肽如Wagner(Wagner等，PNAS，89，7934-8，1992)或Smith(国际专利申请WO97/35070)所述的那些可以锚合复合物形成之前的缩合结构，或锚合预形成的肽DNA复合物，但这也是复杂的制剂制备过程。此外，此类肽在促进基因转移方面显示出比腺病毒低下的有效性(Gottschalk等，Gene Therapy，3,448-457，1996；Wagner等，PNAS，89，7934-8，1992)，因此研究工作仍在继续寻找更加有效的肽。能够缩合DNA并破裂生物膜的肽将简化制剂，并且可以产生更有效的转染。蜂毒肽是一种公认的膜破裂性肽；但是，虽然其成为一种研究最广泛的肽序列，但只有两个实例描述了其在基因传递中的应用。首先，是以与蜂毒肽连接的二油酰基磷脂酰乙醇胺-N-(一种DOPE衍生物)的形式(Legendre等，Bioconjugate Chem.，8,57-63，1997)，其次公开在美国专利US-A-5,547,932中。在Legendre等的描述中，脂质的偶联是一个昂贵和复杂的步骤，而且报导了DOPE体内应用所存在的问题。在美国专利US-A-5,547,932中公开了与核酸结合剂连接的内体分解(endosomolytic)试剂的制剂。所述制剂形成相对无效的转染制剂，其也可能对被转染细胞产生毒性。事实上，蜂毒肽的毒性可以用来解释为什么它至今无法作为单独的肽成功地应用于非病毒制剂中。本专利技术提供一种经修饰的膜破裂性肽，其中膜破裂性肽被修饰成共价连接的多聚体。优选经修饰的膜破裂性肽进一步修饰成基本上连续的α螺旋。现在发现，通过经修饰的膜破裂性肽使其形成多聚体并优选使其形成基本上连续的α螺旋，肽的毒性可以被降低，而且当用于向细胞传递核酸时，该肽产生增高了的转染水平。不受任何理论的约束，建议膜破裂性肽必须采取单体的形式以便能够插入膜中，在其中聚集形成管孔。管孔的形成肯定对细胞具有毒性，因为它增强了被动的离子通透性。肽的多聚化阻止了单体的形成，由此防止管孔形成且降低细胞毒性。多聚体由于非极性两亲性α螺旋占优势而仍然保留了一些膜破裂特性。肽通过修饰可以获得基本上连续的α螺旋；由于基本上连续的α螺旋可以实现与细胞膜的相互作用，因此提高了肽的膜破裂特性。肽的多聚化也具有优越性，使肽无法从任何结合的核酸上解离下来。术语“膜破裂性肽”是指能够促进膜破裂并降低分子横贯膜所需要的能量的肽。利用试验如红细胞溶解试验可以测定出一种肽是否是膜破裂性肽；然而，不同的膜破裂性肽具有不同的细胞特异性，其可以溶解不同于红细胞的细胞。因此，在溶胞试验中应采用其他细胞种类来测定一种肽是否是膜破裂性肽。膜破裂性肽优选是一种毒性膜破裂性肽。进一步优选膜破裂性肽是通过将其自身以单体的形式向膜内插入来产生毒性。更加优选膜破裂性肽是毒性α螺旋膜破裂性肽，例如蜂毒肽、杀菌肽A、杀菌肽P1、杀菌肽D、爪蟾抗菌肽2、铃蟾抗菌肽(bombolittin)类或pardaxin(Saberwal等，Biochimica et Biophysica Acta，1197，109-131，1994)。优选膜破裂性肽构成一种两亲性α螺旋，该螺旋具有一个富集阳离子残基且能够缩合DNA的面，和一个能够与膜脂质相互作用的疏水面。另外，优选膜破裂性肽含有α螺旋区域和位于肽的C末端的碱性区域，该碱性区域可以与核酸缩合。优选膜破裂性肽不是人体杀菌/渗透性增强蛋白(BPI)(Gray等，J.Biol.Chem.，264，9505，1989和美国专利US-A-5,856,302)。优选膜破裂性肽是蜂毒肽。在此所用的术语“肽”是指具有10至150个氨基酸链长的氨基酸的聚合物。该术语不是指或不包括肽的修饰，例如糖基化、乙酰化和磷酸化。该定义包括含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)的肽，具有取代键以及其他所属领域已知的修饰的肽，包括天然或合成的。术语“修饰成多聚体”是指修饰膜破裂性肽使其共价连接一种或多种其他膜破裂性肽。优选该多聚体是二聚体、三聚体或四聚体，更优选是二聚体和四聚体，首选二聚体。形成多聚体的膜破裂性肽可以相同或不同。膜破裂性肽可以沿肽的长度在任何位点连接在一起；然而，优选肽在各个肽的N末端和/或C末端连接在一起，最优选肽在各个肽的N末端连接在一起。优选地，通过用能够经二硫键或连接基团与另一种经修饰的膜破裂性肽的氨基酸直接形成共价键的氨基酸替换膜破裂性肽的氨基酸，可以使膜破裂性肽修饰成二聚体。另外，经二硫键或经连接基团直接形成共价键的氨基酸可以增加于膜破裂性肽中。优选增加的或替换肽氨基酸的氨基酸为半胱氨酸，其可以与另一种肽的半胱氨酸残基形成二硫键。形成二聚体的膜破裂性肽不一定相同；然而，优选形成二聚体的肽相同。优选地，通过用两个或多个能够经二硫键或经连接基团与其他经修饰的膜破裂性肽的氨基酸直接形成共价键的氨基酸替换两个或多个氨基酸，可以使膜破裂性肽修饰成三聚体或四聚体。另外，可以将两个或多个能够直接或经连接基团形成二硫键的氨基酸增加在膜破裂性肽中。形成三聚体或四聚体的膜破裂性肽不一定相同；然而，优选形成三聚体或四聚体的肽相同。膜破裂性肽可以经连接体如市售连接体相连在一起，所述连接体包括双马来酰亚胺或双乙烯基砜连接体。术语“基本上连续的α螺旋”是指形成α螺旋并且不含有一个或多个破坏该α螺旋形成的氨基酸的膜破裂性肽的区域。优选该基本上连续的α螺旋在长度上至少为10个氨基酸。优选所述的基本上连续的α螺旋占该经修饰的膜破裂性肽长度的至少5％，更优选占该经修饰的膜破裂性肽长度的40％-90％，最优选占该经修饰的膜破裂性肽长度的约80％。利用标准圆二色分析法可以很容易地测定出肽中α螺旋的存在。可以破坏α螺旋形成的氨基酸包括脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸。然而，所属领域技术人员理解，氨基酸破坏α螺旋的能力依赖于肽的整体序列和其他因素，例如肽折叠的溶液的pH。优选的可以破坏α螺旋形成的氨基酸是脯氨酸。优选膜破裂性肽通过用不破坏α螺旋形成的氨基酸来替换破坏α螺旋形成的氨基酸而修饰成基本上连续的α螺旋。在一个优选实施方式中，本专利技术的经修饰的膜破裂性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经修饰的膜破裂性肽，其中所述膜破裂性肽被修饰成共价连接的多聚体。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗斯欧文菲利普斯，约翰汉密尔顿韦尔什，朗达达尔菲侯塞因，
申请(专利权)人：科布尔药物有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]