编码参与子叶和侧根发育的转录因子的植物基因NAC1制造技术

从拟南芥属中分离了一种新基因ｎａｃｌ，这一基因编码的蛋白质（ＮＡＣｌ）被鉴别为是ＮＡＣ家族的一个成员。ＮＡＣｌ与ＮＡＣ基因产物的其它成员在Ｎ－末端具有高度氨基酸序列同源性。数据显示ＮＡＣｌ属于新鉴别的转录因子家族。ＮＡＣｌ参与子叶和侧根发育的调节。所述基因的过表达可导致产生具有比野生型植物大的植物，该植物具有更大的根和更多的侧根。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
NAC基因(包括NAM，ATAF1，ATAF2和CUC2)属于目前只在植物中发现的相对大的基因家族。这些基因编码的蛋白质在其N末端至170位氨基酸是保守的，但在其C末端是高趋异的。先前在矮牵牛属植物(Souer等，1996)和拟南芥(Aida等，1997)中进行的遗传研究推测NAC家族的一些成员在茎干(shoot)和花分生组织的图式发育中起作用。携带无顶端分生组织(nam)突变的矮牵牛属植物胚胎不能发育为茎尖分生组织。nam幼苗上的偶见的茎干所开的花在第二轮发育为10个而不是5个原基。具有同源异型基因green petals的双突变体示出nam在第二轮中的作用不依赖于器官相同性，且在第三轮中也影响原基数。令人惊奇的是，nam mRNA在分生组织和原基的边界的细胞中累积。现已示出nam在确定分生组织和原基的位置中起作用(Souer等，1996)。拟南芥的基因CUC1和CUC2(代表杯状子叶，CUP-SHAPEDCOTYLEDON)中的突变，导致子叶(胚胎器官)，萼片和雄蕊(花器官)的分离以及茎尖分生组织的形成发生缺陷。这些缺陷大多数在双突变体中呈现。突变体的表型提示在胚胎和花中相同轮内分离相邻器官有一通用机制。克隆CUC2基因，发现其编码与矮牵牛属植物NAM蛋白同源的蛋白质(Aida等，1997)。本文所用的举例说明本专利技术的背景，或提供另外关于实施的阐述的出版物及其它材料并入参考，并分别列于所附参考文献表中。本专利技术阐述了一种新的拟南芥NAC家族成员NAC1。此基因最初通过当过表达时其cDNA改变酵母S.pombe细胞形态的能力而分离(Xia等，1996)。Northern分析显示NAC1以组织特异性方式在根中高水平表达，在叶中低水平表达。原位全样载片实验显示在活性分裂的根和茎干分生组织中表达。NAC1与NAC基因产物的其它成员在N末端呈高度氨基酸序列同源。利用重组GST-NAC1蛋白和不同的截短的NAC1衍生物的体外DNA结合研究，表明35S启动子的-90区和该蛋白质保守的N末端结构域之间由相互作用。令人感兴趣地，酵母分析显示融合于GAL4 DNA结合结构域的NAC1的C末端能激活转录。不同的缺失融合分析显示反式激活结构域位于NAC1蛋白的C末端。另外，双杂交分析表明NAC1可同源二聚体化，且二聚体化结构域位于蛋白质保守的N末端区。一个21bp推定的二分核定位信号序列发现在N末端保守的NAC结构域中。在地塞米松(Dex)诱导的启动子-GVG系统的控制下，用GFP-NAC1融合结构产生转基因拟南芥。对在Dex诱导条件下表达GFP-NAC1融合蛋白的转基因品系的分析揭示了体内嵌合多肽的核定位。这些数据表明NAC1属于新鉴别家族的转录因子。本专利技术第一方面是包含一种基因的转基因植物，这种基因编码NAC1或功能等价蛋白(指与NAC1一样结合相同DNA结合位点的蛋白质，且与NAC1至少有70％，优选80％，更优选90％，最优选95％的相同性)，使转基因植物比非转基因植物生长的大。该植物可以是因为它较重，因为它有较大的叶，较粗的干，更多的根，和/或具有较大的根而较大。本专利技术第二方面是一种编码NAC1或功能等价蛋白的基因，其中此基因的转基因植物比非转基因植物生长的大。本专利技术的第三方面是NAC1或功能等价蛋白，其中如果植物是用编码NAC1或所述功能等价蛋白的基因转基因生产的，则所述转基因植物将比未转基因植物生长的大。本专利技术的另一方面是转基因植物细胞，其含有编码NAC1或功能等价蛋白的基因，使植物细胞比非转基因细胞生长的大。图2幼苗及花中NAC1的原位全样载片研究。原位全样载片杂交用地高辛(DIG)标记的C末端特异的反义探针(A，B，C，D和E)，和DIG标记的有义探针(F和G)在幼苗和花中进行的。A和F是12天的幼苗。根材料取自12天幼苗，D是7天幼苗。花取自40天土壤生长植物。图3与CaMV 35S启动子-90区结合的GST-NAC1融合蛋白。(A)GST-NAC1融合蛋白结合35S启动子-90区的亲和性。蛋白质数量如下1泳道，500ng GST蛋白。2-9泳道是NAC1融合蛋白。2和6泳道，10ng；3和7泳道，100ng；4和8泳道，250ng；5和9泳道，500ng。作为非标记竞争剂，使用未标记的相同DNA片段。(B)与GST融合的NAC1的不同缺失图。(C)与CaMV 35S启动子的-90区结合的NAC1融合蛋白的不同缺失。使用20ng每种重组蛋白。图4酵母双杂交系统分析中NAC1和NAC1之间的特异相互作用。酵母HF7c细胞用表达GAL4BD或GAL4BD-NAC1融合体的质粒，及表达GAL4AD或GAL4AD-NAC1融合体的质粒共转化。(A)根据图中心所示分布状态，细胞在有或无组氨酸加上10mM 3-AT(Sigma)的平板上划线培养。在无组氨酸的情况下生长的能力依赖于GAL4活性的功能重建。(B)与pGA载体融合的NAC1蛋白的不同缺失图。(C)双杂交系统分析中NAC1不同缺失体之间的相互作用能力。图5NAC1蛋白中反式激活结构域的定位。将NAC1的不同缺失体克隆入Gal4 DNA结合载体中并转化入酵母菌株HF7c中。将转化混合物铺板于具有或不具有组氨酸且补加必需氨基酸的MM平板上。结果取自生长3天后的平板。图6植物中NAC1过表达的影响。(A)在无Dex情况下生长的野生型植物。(B)在有Dex情况下生长的野生型植物。(C)在无Dex情况下生长的转基因植物。(D)在有Dex情况下生长的转基因植物。图7C末端特异性反义植物中子叶发育变化。SEM示出子叶的远轴表面。A和D是野生型的，B和E是无严重表型的，C和F，G是严重表型的。字母A，B，和C框内示出详细区域。图8野生型或具有反义NAC1的转基因植物种子在MS或MS+Dex培养基上发芽生长。(A)在无Dex情况下生长的野生型植物；(B)用Dex诱导的野生型植物；(C)在无Dex情况下生长的转基因植物；和(D)用Dex诱导的转基因植物。专利技术详述在用Schizosaccharomyces pombe分离植物细胞骨架，细胞周期相关和极性相关蛋白质的计划中分离到nac1基因。将一个在pREP5N的硫胺素阻抑型nmt1启动子的控制下的A.thaliana cDNA文库转化入野生型S.pombe细胞中。当启动子脱阻抑时，一个转化体示出延伸的细胞和多隔性(multiseptimas)。一个cDNA克隆分离自此转化体并再转化入S.pombe中，以证实细胞形态改变是由于该cDNA′表达所致。此分离的cDNA(At012)编码324个氨基酸(SEQ ID NO2)的一个开放读框(ORF)。与GenBank相对照探查此推定的蛋白质序列。BLAST探查表明此蛋白质是新的。此蛋白质的N末端发现含有NAC结构域，这是一个在NAC基因家族的成员(NAM，ATAF1，ATAF2，CUC2)中发现的结构域。此结构域覆盖蛋白质的前175个氨基酸。由nac1编码的蛋白质的剩余部分与任何已知序列无高度同源。多肽的同源性是用序列分析软件测定的。例如，威斯康辛大学生物技术中心遗传学计算机小组的序列分析软件包(910 UniversityAvenue，Madison，Wisco本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的８９－１０６０位碱基的核酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢旗，蔡南海，
申请(专利权)人：分子农业生物学院，
类型：发明
国别省市：SG[新加坡]