一种中性植酸酶、编码该酶的基因以及含有该酶的饲料制造技术

本发明专利技术提供了一种能够表达中性植酸酶的枯草芽孢杆菌，保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．０５１５。本发明专利技术还提供了一种中性植酸酶，它具有如说明书所述的氨基酸序列。本发明专利技术还提供了编码本发明专利技术的中性植酸酶的基因和含有本发明专利技术中心植酸酶的饲料。本发明专利技术的中性植酸酶可广泛用于鲤鱼、鲫鱼、鲂鱼、鲭鱼、鲢鱼等所有无胃的鱼类饲料中。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种植酸酶，编码这种植酸酶的基因和含有这种酶的饲料。磷是一种所有动物生长都需要的重要矿物质。磷占动物机体矿物质总量的四分之一还多，其中80％的磷以羟磷灰石的形式存在于骨胳中。骨骼不仅作为身体的骨架，而且也是钙、磷和其他矿物质的贮存库，当需要时它们能动员到其它组织中。另外的20％的磷存在于肌肉、血液和其它软骨组织中，它们作为许多有机化合物的组成成分，参与体内几乎每一种生命所需的生理生化反应。由于磷有如此重要的生物学功能，所以在动物日粮中提供充足的磷是非常重要的。否则，组织的生长受到抑制、骨骼变软变脆，长期磷缺乏会导致生长动物的佝偻病和成年动物的骨质疏松症，从而影响动物的生长性能。目前在单胃动物如鸡、猪等饲料和鱼类饲料中是添加无机磷如磷酸氢钙、磷酸二氢钙来满足动物对磷的需求。但是在主要以植物性饲料为主的动物日粮中本身就含有丰富的磷，只不过是因为它们主要以动物不能利用的植酸磷的形式存在而已。植酸磷是谷物、豆类和油料等作物籽实中磷和肌醇的基本贮存形式，含量高达1-5％(Lolas M.Et a1.Food Sci.421094-1097，1977).它占植物中总磷的60-80％(Nelson T.S.Poultry Sci.47862-871，1967).但是以植酸磷形式存在的磷却因单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶而难以被利用(Cromwell G.L.Biotechnology in the Feed Industry，Lyons T.P.ed.AlltechTechnical Publication，Nicholasville，KY，133-145)，其利用率仅在0-40％。植酸磷不能被单胃动物和鱼类有效利用，从而在饲喂过程中造成了许多问题，第一、造成磷源浪费。一方面饲料中的磷源不能得到有效利用，另一方面为了满足动物对磷的需求，又必须在饲料中额外添加无机磷，提高了饲料成本。在实际生产中，添加无机磷时还常因无机磷中残留有氟、重金属等元素而造成动物中毒。第二、形成高磷粪便而污染环境。饲料中85％左右的植酸磷会被动物直接排出体外，粪便中大量的磷使水和土壤受到严重污染。目前许多欧洲国家如荷兰等已因此问题开始限制畜禽的养殖数量。我国是畜牧生产大国，单胃动物占畜禽总数的比例远高于西方国家，因此，防止磷对环境的污染在我国更具有特殊的意义。第三、植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物肠胃道的消化吸收过程中会与多种金属离子Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，从而降低了动物对这些营养元素的有效利用(Sharma C.B.et al.，Phytochemistry.17201-204，1978)。植酸酶(EC.3.1.3.8)是一种能水解植酸的酶类。它能将植酸磷降解为肌醇和磷酸。植酸酶广泛存在于微生物中，如假单孢杆菌(Cosgrove D.J.，Austral.J.Biol.Sci.231207-1220，1970)，乳酸杆菌(Shirai K.，LettersAppl.Biol.Sci.19366-369，1994)，大肠杆菌(Greiner R.，Arch Biochem.Biophys.303107-113，1993)，酵母(Nayini N.R.et al.Lebensm Wiss.Technol.1724-26，1984)，曲霉(Yamada K.et al.Agric.Biol.Chem.321275-1282，1986；Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent No.5436156，1995)。其中来源于A.ficuum NRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶(Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent No.5436156，1995)具有较好的耐热性，在酸性条件下有较高的酶活性，被认为是目前最有应用前景的饲用植酸酶，它的最适pH值为2.5和5.5，最适温度为55℃，特异比酶活性为1×105U/mg酶蛋白。植酸酶对单胃动物的饲喂效果已在世界范围内得到了确证(Ware J.H.et al.，US Patent No.3297548，1967；Nelson T.S.et al.，J.Nutrition 1011289-1294，1971；Nelson T.S.et al.，Poult Sci.471842-1848，1968)。它可使植物性饲料中磷的利用率提高60％，粪便中磷排泄量减少40％，还可降低植酸磷的抗营养作用。因此对提高畜牧业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。以往的研究都集中在用于单胃畜禽动物饲料中的酸性植酸酶，多种微生物来源的酸性植酸酶的编码基因已被分离克隆，如来源于酵母Saccharomyces cerevisiae(Bajwa et al.，1984；Meyhack et al.，1982)、Aspergillus niger(MacRae，1988)、A.terreus和Myceliophthora thermophila(Van Loon，1995)、A.niger(ficuum)(Van Hartimgsveldt et al.，1993；Ehlich etal.，1993；Bin Y et al.，1998)、A.niger var.awamori(Piddington et al.，1993)、Talaromyces thermophilus(Pasamontes L et al.，1997)、Talaromyceslanuginosus(Berka R M et al.，1998)、Emericella nidulans(Pasamontes L et al.1997)、Schwanniomyces occidentalis(Mochizuki，1998)等的植酸酶。这些植酸酶的最适pH都在6.0以下，在pH6.5以上基本没有酶活性。但这些植酸酶却不能用于无胃的鱼类饲料中。绝大多数淡水鱼类如清鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲂鱼等和部分海水养殖鱼类均是无胃鱼类。对单胃畜禽而言，植酸酶的主要作用场所是单胃动物酸性的胃中，因而要求植酸酶在酸性条件下要有较高的酶活性，即酶反应的最适pH值为酸性的植酸酶，如国外目前商品化生产的来源于A.ficuumNRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶PHYA(Van Gorcom et al.，1995)，它的最适pH值为2.5和5.5。我国用基因工程酵母生产的植酸酶PHYA2最适pH值为1.8和5.5(姚斌等，中国专利公开号CN1184156A)。而对于淡水养殖的主要鱼类来说，它无胃，只有pH值呈中性(pH6.5～8.0)的肠道，因而在鱼类饲料中必需使用在中性pH值条件下有高活性的植酸酶。目前商品化生产的用于单胃畜禽的植酸酶在中性pH值环境下基本没有酶活性，因而不能用于这些鱼类饲料。本专利技术所述的具有中性植酸酶活性的植酸酶是指最适pH在6-9的植酸酶。本专利技术的一个目的是筛选一种反应最适pH在中性的、能用于无胃鱼类的中性植酸酶并克隆中性植酸酶的编码基因，为进一步通过基因工程的方法，利用重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够表达中性植酸酶枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）９８，其保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．０５１５。

【技术特征摘要】
1.一种能够表达中性植酸酶枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)98，其保藏号为CGMCC No.0515。2.一种从权利要求1所述的微生物分离的中性植酸酶。3.按照权利要求2所述的中性植酸酶，它具有如下所示的氨基酸序列，或者如下所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的替换、缺失、加入，而同时具有中性植酸酶活性的的序列K H K L S D P Y H F 36T V N A A A Q T D P V D T A G D A A 54D D P A I W P D P K T P Q N S K L I 72T T N K K S G L V D L T L D G K M L 90H S Y N T G K L N N V D I R Y D F L 108L N G K K V E I A A A S N R S E G K 126N T I E I Y D I D G K N G T L Q K M 144T I P D H P I G T A I N A V Y G F T 162L Y H S K K T G K Y Y A T V T G K E 180E P L Q K E E L K A D N N G Y I S G 198K K V A A F S E N S Q T A G M E K G 216D E V G R L Y I A E E D E A I W K F 234S A E L D G G S A A T V I D R A D G 252R H L T R D I E G L T I Y Y A A D G 270K G Y L M L S Q Q G N S S Y A I Y I 288I Q G K N K Y V A D F R I M D G P E 306T D G T S D T D G I D V L G F G L G 324P E Y P F G I F V A Q D G E N I D H 342G Q K A N Q N F N I V K W E R I A D...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，范云六，王亚茹，史秀云，操时树，袁铁铮，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]