CAS9分子/指导RNA分子复合物的评价制造技术

本文披露了用于评价、选择、优化和设计Cas9分子/gRNA分子复合物的方法。

Evaluation of CAS9 / RNA molecular complex

This paper has disclosed a method for evaluating, selecting, optimizing and designing the Cas9 molecular /gRNA molecular complex.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CAS9分子/指导RNA分子复合物的评价相关申请的交叉引用本申请要求2015年4月24日提交的美国临时申请号62/152,473的优先权。
本专利技术涉及Cas9分子/指导RNA(gRNA)分子复合物的评价、选择和设计。
技术介绍
Cas9核糖核蛋白(RNP)复合物的直接递送允许有效地进行基因编辑，同时由于Cas9蛋白在细胞中的快速周转而使脱靶活性最小化。通过与体外转录或化学合成的指导RNA(gRNA)复合的经纯化的Cas9蛋白的阳离子脂质递送，可以在各种哺乳动物细胞中实现基因编辑。由RNP递送介导的基因编辑的效率随着基因座而变化，并且取决于gRNA的长度、以及递送的Cas9蛋白和gRNA的量和比例。鉴于RNP复合物的双组分性质，需要精确的条件来获得Cas9蛋白和gRNA之间完整且有生产力的复合物形成。虽然蛋白质和RNA的量可以通过染料结合测定(例如Bradford染料结合测定或核糖定量RNA测定)进行定量，但是这些技术不能提供基因编辑活性所需的生产性RNP复合物的定量。Cas9/gRNA复合物的结构和生物物理学表征显示出大的接触面积和高的亲和力。热熔曲线是表征蛋白质-配体复合物的稳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选用于给予受试者的Cas9分子/gRNA分子复合物的方法，所述方法包括：(a)产生多个样品，每个样品包含通过将Cas9分子和多个gRNA分子中的一个进行组合而产生的Cas9分子/gRNA分子复合物；(b)检测所述多个样品中每个中的所述Cas9分子/gRNA分子复合物的熔融温度(Tm)值；以及(c)基于以下项中的一项或多项来从所述多个样品中选择至少一个样品：(i)所述多个样品中的Tm值与参考Cas9分子/gRNA分子复合物的Tm值或预定阈值Tm值的比较，或(ii)所述多个样品的Tm值的相对排序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.24 US 62/152,4731.一种筛选用于给予受试者的Cas9分子/gRNA分子复合物的方法，所述方法包括：(a)产生多个样品，每个样品包含通过将Cas9分子和多个gRNA分子中的一个进行组合而产生的Cas9分子/gRNA分子复合物；(b)检测所述多个样品中每个中的所述Cas9分子/gRNA分子复合物的熔融温度(Tm)值；以及(c)基于以下项中的一项或多项来从所述多个样品中选择至少一个样品：(i)所述多个样品中的Tm值与参考Cas9分子/gRNA分子复合物的Tm值或预定阈值Tm值的比较，或(ii)所述多个样品的Tm值的相对排序。2.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述多个样品中每个样品中的所述Cas9分子/gRNA分子复合物的Tm值的步骤包括通过差示扫描荧光测定法(DSF)评估所述多个样品中的每个样品。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述gRNA是嵌合gRNA。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述gRNA是模块化gRNA。5.一种Cas9分子和gRNA分子的经分离的复合物，所述经分离的复合物在根据权利要求1-2之一所述的方法而选择的所述gRNA分子不存在的情况下，具有比所述Cas9分子的Tm值大至少8℃的熔融温度(Tm)。6.一种包含Cas9分子和gRNA分子的经分离的复合物的组合物，所述经分离的复合物在根据权利要求1-2之一所述的方法而选择的所述gRNA分子不存在的情况下，具有比所述Cas9分子的Tm大至少8℃的熔融温度(Tm)。7.如权利要求6所述的组合物，其中通过差示扫描荧光测定法(DSF)评估Cas9分子和gRNA分子的非天然存在的复合物的熔融温度(Tm)与不存在所述gRNA分子下的所述Cas9分子的熔融温度(Tm)之间的差异。8.如权利要求6所述的组合物，其中所述gRNA是嵌合或模块化gRNA。9.一种确定Cas9分子/gRNA分子复合物的稳定性的方法，所述方法包括：(a)产生多个Cas9分子/gRNA分子复合物，每个复合物包含通过将Cas9分子和多个gRNA分子中的一个进行组合而产生的Cas9分子/gRNA分子复合物；(b)检测所述多个Cas9分子/gRNA分子复合物中每个Cas9分子/gRNA分子复合物的熔融温度(Tm)值；以及(c)如果所述Cas9分子/gRNA分子复合物的Tm值大于参考分子的Tm值或Tm参考值，则确定所述多个Cas9分子/gRNA分子复合物中的一个或多个是稳定的。10.一种确定促进稳定的Cas9分子/gRNA分子复合物的条件的方法，所述方法包括：(a)将样品中的Cas9分子和gRNA分子组合以形成Cas9分子/gRNA分子复合物；(b)检测所述Cas9分子/gRNA分子复合物的熔融温度(Tm)值；以及(c)如果所述Cas9分子/gRNA分子复合物的Tm值大于参考分子的Tm值或Tm参考值，则确定所述Cas9分子/gRNA分子复合物是稳定的。11.一种筛选稳定的Cas9分子/gRNA分子复合物的方法，所述方法包括：(a)通过差示扫描荧光测定法(DSF)检测Cas9分子/gRNA分子复合物的熔融温度(Tm)值；以及(b)如果所述Cas9分子/gRNA分子复合物的Tm值大于参考分子的Tm值或Tm参考值，则确定所述Cas9分子/gRNA分子复合物是稳定的。12.一种用于鉴定最佳gRNA以形成稳定的Cas9分子/gRNA分子复合物的方法，所述方法包括：(a)将样品中的Cas9分子和gRNA分子组合以形成所述Cas9分子/gRNA分子复合物；(b)检测所述Cas9分子/gRNA分子复合物的熔融温度(Tm)值；以及(c)如果所述Cas9分子/gRNA分子复合物的Tm值比参考分子的Tm值或Tm参考值大至少8℃，则确定所述Cas9分子/gRNA分子复合物是稳定的。13.一种确定Cas9分子/gRNA分子复合物的稳定性的方法，所述方法包括：(a)将样品中的Cas9分子和gRNA分子组合以形成所述Cas9分子/gRNA分子复合物；(b)检测所述Cas9分子/gRNA分子复合物的熔融温度(Tm)值；(c)测量所述Cas9分子/gRNA分子复合物的活性值；以及(d)如果(i)所述Cas9分子/gRNA分子复合物的Tm值大于参考分子的Tm值或Tm参考值，和(ii)所述Cas9分子/gRNA分子复合物的活性值大于参考分子的活性值或活性参考值，则确定所述Cas9分子/gRNA分子复合物是稳定的。14.一种优化gRNA分子与Cas9分子的结合以形成稳定的Cas9分子/gRNA分子复合物的方法，所述方法包括：(a)将样品中的Cas9分子和gRNA分子组合以形成Cas9分子/gRNA分子复合物；(b)检测所述Cas9分子/gRNA分子复合物的熔融温度(Tm)；(c)确定所述Cas9分子/gRNA分子复合物的Tm值与参考分子的Tm值或Tm参考值之间的Δ值；以及(d)如果所述Δ值为至少8℃并且所述Cas9分子/gRNA分子复合物的Tm值大于所述参考分子的Tm值或所述Tm参考值，则确定所述Cas9分子/gRNA分子复合物是稳定的。15.一种检测稳定的Cas9分子/gRNA分子复合物的方法，所述方法包括：(a)检测参考分子的热稳定性值；(b)将样品中的Cas9分子和gRNA分子组合以形成Cas9分子/gRNA分子复合物；(c)测量Cas9分子/gRNA分子复合物的热稳定性值；以及(d)如果所述Cas9分子/gRNA分子复合物的热稳定性值大于所述参考分子的热稳定性值，则确定所述Cas9分子/gRNA分子复合物是稳定的。16.如权利要求15所述的方法，其中所述热稳定性值是变性温度值，并且所述热稳定性参考值是变性温度参考值。17.如权利要求15所述的方法，其中所述热稳定性值是熔融温度(Tm)值，并且所述热稳定性参考值是Tm参考值。18.如权利要求9-11、13和17中任一项所述的方法，其中如果所述Cas9分子/gRNA分子复合物的Tm值比所述参考分子的Tm值或Tm参考值大至少1℃、至少2℃、至少3℃、至少4℃、至少5℃、至少6℃、至少7℃、至少8℃、至少9℃、至少10℃、至少11℃、至少12℃、至少13℃、至少14℃、至少15℃、至少16℃、至少17℃、至少18℃、至少19℃或至少20℃，则所述Cas9分子/gRNA分子复合物是稳定的。19.如权利要求18所述的方法，其中如果所述Cas9分子/gRNA分子复合物的Tm比所述参考分子的Tm值或Tm参考值大至少8℃，则所述Cas9分子/gRNA分子复合物是稳定的。20.如权利要求9-11、13和17中任一项所述的方法，其中如果所述Cas9分子/gRNA分子复合物的Tm值比所述参考分子的Tm值或Tm参考值大约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·亚拉姆，W·小塞莱克，
申请(专利权)人：爱迪塔斯医药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US