人核糖核酸酶U和人溶菌酶的两种进化酶制造技术

本发明专利技术涉及两种人源酶的分子进化酶。本发明专利技术的进化酶分别是以人核糖核酸酶Ｕ和人溶菌酶为原料，经过基因钓取，定向进化，表达筛选等步骤，最后制得。本品具有制备工艺简单、生产成本低、酶活力较高、稳定性好、应用价值大等优点，可独自或联合广泛地应用于抗菌药物、抗病毒药物、抗炎症药物、治疗龋齿药物、治疗爱滋病药物等医药工业各领域。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一类定向进化制备的进化酶，特别是涉及由人核糖核酸酶U和人溶菌酶通过定向进化制备的人核糖核酸酶U进化酶和人溶菌酶的进化酶。近年来，随着现代生物工程技术的日新月异，以酶为主要研究对象的蛋白质工程技术发展非常迅速。在蛋白质工程研究方面，有关分子工程制备的进化酶、模块酶和杂合酶的研究日益受到重视。尤其是表达克隆(expression cloning)、分子筛选(molecular screening)、人工进化(artificial evolution)、DNA改组(DNA Shuffling)和体外突变技术开发的成功，为定向进化制备进化酶的开发与生产铺平了道路。天然蛋白质功能的进化有一部分是通过结构域或亚结构域的重组来实现的，例如底物结合结构域，调节结构域，催化结构域这些相互独立的结构域之间的重组。这不但可以进化某种功能，还可以创造出新的功能，因为酶的活性位点位于不同的折叠单位相互作用的界面上。基因工程与蛋白质工程应用于酶学的主要目的是通过改变天然酶的特性，创造具有新特性或性能有所改善的酶。获得新酶的原因有许多方面(1)天然酶在现存的工业条件下(例如在有机相、极端温度和pH)的稳定性较差或其催化效率很低；(2)天然酶在工程菌中的折叠效率较差或对蛋白酶敏感；(3)酶的催化活性需要提高或降低；(4)需要创造具有新反应活性的酶。定向进化制备的进化酶主要应用于改变酶的非催化特性；创造具有新活性的酶；研究酶的结构与功能之间的关系等。在新酶的开发和现有酶的改造利用方面，定向进化技术显示了它巨大的应用前景。对酶的分子改造，几十年来的工作都着眼于两个方面，一是基于序列的合理化设计方案(Sequential rational design)，如化学修饰，定点突变(site-directed mutagenesis)等。一是利用基因的可操作性，模拟自然界的演化进程的非合理化设计方案(irrational design)，如定向进化(directedevolution)，杂合进化(hybrid evolution)等。对酶分子的研究可以分为认识和改造两个方面。前者是利用各种生物化学，晶体学，光谱学等方法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶分子特征、空间结构、结构和功能之间关系以及氨基酸残基功能等方面的信息。以此为依据对酶分子进行改造，称为酶分子的合理性设计。与此相对应，不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变，基因重组，定向筛选等方法对其进行改造，则称为酶分子的非合理性设计。非合理性设计的实用性较强，往往可以通过随机产生的突变，改进酶的特性。对酶分子的设计与改造方法，是基于基因工程、蛋白质工程和计算机技术互补发展和渗透的结果。它标志着人类可以按照自己的意愿和需要改造酶分子，甚至设计出自然界中原来并不存在的全新的酶分子。在目前，酶的分子工程改造还不成熟的情况下，通过定点突变技术改造成功了大量的酶分子，获得了比天然酶活力更高，稳定性更好的工业用酶。但总体说来，我们的能力并未达到对复杂的生物体系进行有效的人为改造的水平。近年来，易错PCR，DNA shuffling和高突变菌株等技术的应用，在对目的基因表型有高效检测筛选系统的条件下，建立了酶分子的定向进化策略，尽管不清楚酶分子的结构，仍能获得具有预期特性的新酶，基本上实现了酶的分子改造。酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业化要求，天然的酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其它性质。因此对天然酶分子水平上的改造，显得十分重要和必要。天然酶在自然条件下已经进化了千百万年，但是酶分子仍然蕴藏着巨大的进化潜力，这是酶的分子改造的基本先决条件。酶分子存在着分子改造的潜力主要原因在于1、天然酶在生物体内存在的环境与酶的实际应用环境不同。一个比较好的例子是把枯草杆菌蛋白酶E应用于非水相(二甲基甲酰铵，DMF)，催化肽合成反应，自然生理条件下进化得比较完善的枯草杆菌蛋白酶E，由于没有接触过非水环境，因此其活性和稳定性不适合在有机相中完成催化反应，这就为该酶在新的筛选条件下(有机相中)提供了适合该条件的改造空间。2、实际应用中，总是期待酶的活性和稳定性越高越好，这样可以加快反应速度、提高酶的利用率、降低反应成本，但在生物体内更重要的是各种生物分子之间协同作用，作为一个整体去适应环境。生物对环境适应的进化主要不是表现为某个酶分子的活性和稳定性的不断提高，而是在于整体的适应能力，调控能力的增强。在自然选择的筛选压力下，更主要是这个系统中的瓶颈部分的进化。对于某个酶分子来说，其活性可以受到调节部位的调节，含量可以受到基因表达的调控，而当其酶活性和稳定性已经超过了满足整个体系在环境中生存的需求时，它们的提高就显得没有必要了，即失去了进化的筛选压力，因而进化的机会很有限，这也为体外定向进化留下了很大的进化空间。正如同SOD，SOD在体内的活力已经足以完成歧化生命体系自然产生的超氧离子，因此，在自然氧压下，体外进化基本不会取得进展。3、某些酶或蛋白质待进化的性质不是其在体内所涉及的，例如对蛋白药物改造消除其副作用，这部分性质的改善有着很大的进化潜力。酶的定向进化是从一个或多个已经存在的亲本酶(天然的或者人为获得的)出发经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。我们以对单一酶分子基因进行定向进化为例，来说明酶分子改造的基本实验路线。在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA多聚酶不具有3’→5’校对功能，并控制突变库的大小使其与特定的筛选容量相适合，选择适当条件以较低的比率向目的基因中随机引入突变，进行正向突变间的随机组合以构建突变库，凭借定向的选择(或筛选)方法，选出所需性质的优化酶，从而排除其它突变体。也就是说，定向进化的基本规则是，“获取你所筛选的突变体”。简言之，定向进化＝随机突变+正向重组+选择(或筛选)。与自然进化不同，前者是人为引发的，后者相当于环境，作用于突变后的分子群，相当于通过选择某一方向的进化而排除其它方向突变的作用。酶的定向进化过程完全是在人为控制下进行的，是酶分子朝向人们期望的特定目标进化。尽管用上述定向进化方法可向人类提供新的有价值酶，但酶的功能突变常常被埋没在众多的中性突变和不利突变群中。采用回交(back-crossing)法，将已进化的子代突变酶基因与野生酶基因重组，可排除这种干扰。这样，出现中性突变的频率只是50％，可全部去除不利突变。在定向进化中，尽管突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量。这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。通常，筛选方法必须灵敏，至少与目的性质相关。Venekei等人报道了快速、有效地筛选蛋白水解酶突变体的方法和最佳筛选条件，主要是利用蛋白酶选择平板初选，再配合活性染色(activity staining)和X-光片消化分析(X-ray filmdigestion assay)加以验证，并检测其活力，快速筛选了44000个突变株。Roberts等人采用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性酯酶结合力更强的抑制剂。从含有4900个突变体的基因库中，获得与该酶结合能力高于野本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人核糖核酸酶Ｕ的进化酶，由如下方法制取，（１）基因突变文库的构建：利用基因工程和蛋白质工程原理和方法构建人核糖核酸酶Ｕ和人溶菌酶的突变文库；（２）转化：将突变文库转入受体细胞中，进行表达；（３）进化酶筛选：利用两种酶的特性， 将具有较高活力、较高稳定性和较高应用价值的进化酶筛选出来；（４）建立进化酶表达的培养条件，包括培养基、最适ｐＨ值、最适温度、通气量、搅拌条件、浊度及培养时间、产品分离纯化路线等；其特征在于，所制得的进化酶具有人核糖核酸酶Ｕ的所有优良 特性及具有高的热稳定性、ｐＨ值稳定性，分子量为１５ＫＤ，酶活力大于１０，０００Ｕ／ｍｇ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：张今，王晓平，苟小军，孔祥铎，李爽，朱师珍，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]