改进G/11家族木聚糖酶的稳定性并且扩展其pH范围的方法技术

本发明专利技术涉及蛋白质工程，具体涉及Ｇ／１１木聚糖酶家族，以及编码所述酶的基因。本发明专利技术具体涉及编码内－１，４－β－木聚糖酶（ＥＣ３．２．１．８）的ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉＸＹＮⅡ基因。本发明专利技术描述了如何利用定点诱变改进酶的性质，以使其符合所要应用的工业条件。可利用蛋白质工程改进木聚糖酶的热活性和热稳定性，以及扩展它们的ｐＨ范围。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质工程，具体涉及G/11家族木聚糖酶，以及编码所述酶的基因。本专利技术具体涉及编码内-1，4-β-木聚糖酶(EC3.2.1.8)的Trichodermareesei XYNII基因。本专利技术描述了如何利用定点诱变改进酶的性质，以使其符合所要应用的工业条件。可利用蛋白质工程改进木聚糖酶的热活性和热稳定性，以及扩展它们的pH范围。
技术介绍
木聚糖酶是水解β-1，4连接的吡喃木糖苷链的糖基水解酶。已发现木聚糖酶存在于至少一百种不同的生物中。它们与其它糖基水解酶一起形成了包括超过40种不同酶家族的超家族(Henrissat和Bairoch，1993)。木聚糖酶家族11(以前称G)根据它们在基因序列，蛋白质结构，催化机制的相似性来确定。此家族成员的共同特点是高度的基因同源性，大小约20kDa，具有双取代催化机制(Tenkanen等，1992；Wakarchuk等，1994)。木聚糖酶家族11主要由形成2个大β-折叠的β-链和1个α-螺旋组成。它们形成了一个类似半握的右手的结构，其中的β-折叠称为A-折叠和B-折叠(Torronen&Rouvinen，1997)。由于木聚糖酶家族11的结构稳定并且不易受蛋白酶活性的影响，所以它们在工业应用方面特别有用。此外，木聚糖酶可以经济地大规模生产。已知Trichoderma reesei可以产生三种不同的木聚糖酶，其中木聚糖酶I和II(XynI和XynII)具有最好的特点(Tenkanne等，1992)。XynI分子量19kDa，与XynII相比，它的等电点和最适pH较低(pI5.5，pH3-4)。XynII分子量20kDa，它的等电点为9.0，最适pH5.0-5.5(Torronen&Rouvinen，1995)。木聚糖酶最重要的工业应用是纸浆漂白，织物纤维的改良，生物质的改良以促进动物饲料中它的消化(Prade，1996)。所有这些应用中的共同问题是该酶面临的极端条件。在工业应用中的高温以及与许多木聚糖酶的最适pH不同的pH条件降低了现有木聚糖酶在工业上的有效利用。在饲料应用中，该酶面临饲料制备期间的短时高温(例如90℃下2-5分钟)。但是，该酶的催化活性需要的温度较低(例如约37℃)。这样，该酶应在较低温下保持活性，它不应在高温下不可逆地失活。在应用于纸浆漂白的过程中，来自于碱洗的物料具有较高的温度(＞80℃)和pH(＞10)。没有一种当今市售的木聚糖酶可以在这样的条件下不失活。必须将纸浆冷却，将碱性pH中和，这样才能用当今可得的木聚糖酶进行纸浆处理。但这意味着费用提高。已有人利用蛋白质工程-有时是成功的-稳定木聚糖酶，使之耐受较高温度和pH的变性效应。已从嗜热生物中发现并克隆了几种耐热的，嗜碱和嗜酸的木聚糖酶(Bodie等，1995；Fukunaga等，1998)。但是，在大多数情况下，证明经济数量地生产这些酶是困难的。因此，工业上一般应用不那么耐热的T.reesei木聚糖酶II，因为它可以大量低成本地生产。作为分离新的木聚糖酶或开发生产方法的替代方法，可以设想对当今使用的木聚糖酶进行工程改造，使之在极端条件下更为稳定。环状芽胞杆菌木聚糖酶可以通过二硫桥将其N-末端与C-末端结合，将α-螺旋的N-末端部分与邻近的β-链结合而改进其稳定性(Wakarchuk等，1994)。Campbell等(1995)也通过分子间或分子内二硫键对环状芽胞杆菌木聚糖酶进行了修饰以提高其热稳定性。另一方面，T.reesei木聚糖酶II通过将N-末端区改变为嗜热木聚糖酶的相应部分而改进了稳定性(Sung等，1998)。除热稳定性得到改进外，所述酶也扩展了在碱性pH条件下的活性范围。单点突变(single point mutation)也用于提高短小芽胞杆菌木聚糖酶的稳定性(Arase等，1993)。还对许多其它酶进行了诱变对稳定性影响的研究。通过对比嗜热和嗜温酶的结构，得到了大量信息(Vogt等，1997)。嗜热木聚糖酶的结构信息也给出了影响木聚糖酶热稳定性因素的信息(Gruber等，1998；Harris等，1997)。专利技术概述本专利技术涉及属于糖基水解酶家族11(以前称G)的木聚糖酶。本专利技术提供了经过修饰的木聚糖酶，所述修饰使它们的热稳定性，热活性得到了改变，和/或扩展了它们的pH范围。对Trichoderma reesei木聚糖酶结构的各种修饰，不管是单独的，或者组合的，都产生了本专利技术所述的改变(1)通过用二硫桥(例如，由突变对T2C和T28C；P5C和N19C；T7C和S16C；N10C和N29C形成的桥)将N-末端区结合到该蛋白主体上而提高了该酶的稳定性；(2)通过延伸一个额外的天冬氨酸(+191D)而稳定C-末端，其中该天冬氨酸与第58位的精氨酸(野生型酶中第58位的赖氨酸已换成精氨酸(K58R))形成盐桥；(3)将α-螺旋通过二硫桥与该酶的主体结合而提高该酶的稳定性(例如L105C和Q162C)；(4)在不同位置进行点突变以改进木聚糖酶的稳定性(N11D，T26R，G30H，N67R，N97R，A132R，N157R，A160R，T165N，M169H，S186R)。具体地，本专利技术提供了经过修饰的Trichoderma reesei木聚糖酶，其中氨基酸T2和T28被改变为半胱氨酸，K58改变为能精氨酸，在该酶的C-末端添加了一个天冬氨酸(+191D)，这样在氨基酸T2C和T28C之间形成了二硫桥，在氨基酸K58R和+191D之间形成了盐桥。 附图说明图1木聚糖酶诱变中所用的一组寡核苷酸(密码子改变以下划线标记)。这些序列在所附序列表中为序列1到12。图2表示突变T2C，T28C，K58R，和+191D对T.reesei XynII温度最适值的影响(WT＝野生型酶；Y5＝突变型T.reesei XynII)。图3表示突变T2C，T28C，K58R，和+191D对T.reesei XynII的pH依赖性活性的影响(WT和Y5如图2)。图4表示在不同温度下突变T2C，T28C，K58R，和+191D对T.reeseiXynII的失活效应(WT和Y5如图2)。图5表示在不同温度下突变Q162C和L105C对T.reeseiXynII的失活效应(W.t.＝野生型酶)。专利技术详述源于细菌，酵母和真菌的G/11家族木聚糖酶有共同的分子结构。这样的木聚糖酶例如有黑曲霉(Aspergillus niger)XynA川地曲霉(Aspergillus kawachii)XynC塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)XynA环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)XynA短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)XynA枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XynANeocallimastix patriciarum XynA浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)XynB浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)XynC热紫链霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)XynII赭色嗜热单孢菌(Thermomonospora fusca)Xy本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经过修饰的Ｇ／１１家族的木聚糖酶，与对应的野生型木聚糖酶相比，其热稳定性和ｐＨ值稳定性已提高，其中对所述野生型酶经过如下修饰：－通过二硫桥将该酶的Ｎ－末端区与该蛋白的主体相连，和／或－通过盐桥将该酶的Ｃ－末端区与该蛋白的主体相连 ，或－通过二硫桥将该酶的α－螺旋与该蛋白的主体相连，或－使该蛋白中单个氨基酸突变。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：弗雷德费内尔，奥西特鲁南，马蒂莱索拉，
申请(专利权)人：金内克国际公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]