一种移植材料的制造方法技术

一种移植材料的制造方法，包括以下步骤： 步骤一：制备生物支架； 步骤二：分离培养生物体角膜基质细胞； 步骤三：制备角膜基质细胞－生物支架复合物、并预制角膜基质组织。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术关于，尤其是一种应用于生物体角膜基质环(intrastromal corneal ring，ICR)植入手术的、利用组织工程学构建的移植材料的制造方法。角膜基质环(intrastromal corneal ring，ICR)植入手术就是这样一种新兴的屈光手术。该技术将ICR植入生物体角膜基质的周边约2/3深度处，增加角膜周边厚度，通过ICR力的扩张作用，导致角膜中央区产生弧长缩短效应，使角膜曲率减小，屈光度减小，从而纠正屈光。其区别目前流行的屈光手术(RK、PRK和LASIK手术)的主要特点在于，该手术不损伤角膜结构的完整性，极大避免了这些手术后可能出现的危险，具有有效、稳定、可逆、预期性好、并发症少等优点，因此ICR植入技术很可能成为理想的屈光手术。目前，ICR植入手术所使用的角膜基质环ICR一般有一体开放式环型和两段弧型两形式，相关现有技术可参考第6228114B1号美国专利。已经商业化的ICR通常是采用与生物体适应性较好的聚合体材料制成的透明环状体，如美国专利第6511508B1、6228114B1号。例如，可采用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制作成ICR，而相关地PMMA在角膜内稳定的理化性质已经被证实。但是，所采用的聚合体材料，如PMMA，大多属于非渗透性、非柔韧性以及无孔性材料，这类材料与生物体角膜之间不能达到真正的生物愈合，最终有可能导致角膜溶解、房水渗漏与植入物脱出等晚期并发症。而且，此类聚合体材料(如PMMA)长期存在生物体角膜内可能导致的其他不良生物学反应尚有待于进一步观察和研究。由于ICR植入手术所需要的ICR材料来源的这种不安全因素，已经成为制约该技术进一步广泛开展的严重障碍。近来，随着生命科学、材料科学以及相关物理、化学学科的发展，人们提出了一个新的概念——组织工程。它是应用细胞生物学和工程学原理，研究开发修复、改善损伤组织结构和功能的生物替代物的一门科学。其基本方法是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种生物相容性良好并可被机体降解吸收的生物支架，植入机体组织缺损部位，在支架材料逐步降解过程中，细胞继续增殖并分泌基质，最终形成相应组织，达到修复组织缺损，重建功能的目的。应用组织工程技术重建组织，有望从根本上解决组织器官移植手术供体材料缺乏的问题。此项技术已经成功构建了软骨、骨、肌腱、皮肤等各种组织。因此，将组织工程角膜基质作为ICR材料来源，综合ICR植入技术和组织工程所提供的优质、可靠组织来源的优势，进一步完善ICR植入术式，就成为相关技术人士所关注及研究的课题。本专利技术的技术要点是该移植材料的制造方法包括以下步骤步骤一、制备生物支架；步骤二、分离培养生物体角膜基质细胞；和步骤三、制备角膜基质细胞-生物支架复合物，并预制角膜基质组织。本专利技术移植材料的制造方法进一步包括步骤四，将步骤三中获得的形成细胞-生物材料复合物植入生物体角膜基质板层内，获得新生的组织工程角膜基质组织。步骤一包括取片状直径为14μm的非编织聚羟基乙酸(PGA)纤维3-7mg，剪成直径为5mm的圆盘状，在75％的酒精浸泡消毒30-45分钟后，再用4℃无菌磷酸缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS；含青霉素100u/ml和链霉素100u/ml)反复冲洗3次，室温下自然晾干。步骤二包括在无菌条件下取得生物体眼球，经PBS清洗后，放入消毒盘内；解剖该生物体眼球，分离角膜上皮层、角膜基质层和角膜内皮层组织；取出角膜基质层组织放入4℃的PBS中清洗后，剪成1-2mm3大小的组织块。将组织块置入15ml离心管中，加入150-250u/ml II型胶原酶4-7ml，移入恒温振荡器内，在37℃、振荡频率80-120次/分钟的条件下振荡40-70分钟；收集角膜基质细胞悬液，以1000r/min的速度离心5-8分钟，弃去上清液，经PBS反复冲洗、离心、弃去上清液，再加入培养液10ml，混匀，台盼蓝染色计数，取细胞活力＞75％的角膜基质细胞备用。将角膜基质细胞和培养液的混合体放入5％CO2、37℃饱和湿度培养箱中进行细胞培养。步骤二中使用的培养液为PH7.35-7.45，含10％胎牛血清、 L-谷氨酰胺300μg/ml、维生素C50μg/ml、青霉素100u/ml和链霉素100u/ml。步骤三包括在无菌条件下，用0.25％的胰蛋白酶和0.02％的乙烯二胺四乙酸(Ethylene Diamine-Tetraacidic Acid，EDTA)消化收集经步骤二培养了5-8天的角膜基质细胞，以1～4×107/ml的浓度30～50μl接种PGA，并加入相应的培养液10ml，再放入5％CO2培养箱中进行培养，隔日更换新鲜培养液。步骤三中所使用的培养液为PH7.35-7.45，含10％胎牛血清、 L-谷氨酰胺300μg/ml、维生素C50μg/ml、青霉素100u/ml和链霉素100u/ml的Ham’F-12培养液10ml。本专利技术应用组织工程技术将角膜基质细胞接种于生物材料，形成细胞-生物材料复合物植入角膜基质板层内，获得了新生的组织工程角膜基质组织。经组织工程获得的角膜基质具有与正常角膜基质类似组织学结构，其生物学性能也与正常角膜相类似，具有良好的组织相容性。而且，随着时间的延长，组织工程技术构建的角膜基质组织逐渐呈现透明。一般在术后8周左右，生物支架材料基本降解完全，此时组织工程角膜基质基本接近透明。将由本专利技术获得的角膜基质组织植入生物体角膜基质的周边，增加角膜厚度、以治疗屈光不正，相较现有技术中采用其它聚合体材料的ICR具有更可靠的效果、更稳定、预期性更好。而且这种材料与角膜之间完全可以达到真正的生物愈合，彻底避免其他替代材料移植可能导致的角膜溶解、房水渗漏与植入物脱出等并发症。本专利技术移植材料的制造方法主要包括以下步骤步骤一、制备生物支架；步骤二、分离培养生物体角膜基质细胞；和步骤三、制备角膜基质细胞-生物支架复合物，并预制角膜基质组织。本专利技术移植材料的制造方法进一步包括步骤四，将步骤三中获得的形成细胞-生物材料复合物植入生物体角膜基质板层内，获得新生的组织工程角膜基质组织。以下通过具体的实验来对本专利技术的移植材料物制造方法进行说明以20窝新西兰大白兔作为实验动物，其中新生兔为5天年龄，母兔为60天年龄，体重约3.5-4.5公斤；将实验动物随机分为实验组和对照组。接下来进行本专利技术的步骤一制备生物支架聚羟基乙酸Polyglicolic Acid(PGA)(参阅附图说明图1)。取直径为14μm的片状非编织聚羟基乙酸(PGA)纤维5mg，剪成直径为5mm的圆盘状，在75％的酒精中浸泡消毒45分钟后，用4℃无菌磷酸缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS含青霉素100u/ml和链霉素100u/ml)反复冲洗3次，室温下自然晾干。然后放入直径为100mm培养皿中，备用。再进行步骤二分离培养生物体角膜基质细胞。采用注射过量戊巴比妥钠的方法处死若干新生兔，在无菌条件下取出其眼球，经PBS清洗后，放入消毒盘内。在手术显微镜下，解剖分离所取眼球的角膜上皮层、角膜基质层和角膜内皮层组织；取出角膜基质层组织放入4℃的PBS中清洗；然后，将角膜基质层组织剪成2mm3大小组织块。将剪好的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹谊林，胡晓洁，王敏，
申请(专利权)人：上海第二医科大学附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：