三苯基膦‑壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束及制备与应用制造技术

本发明专利技术提供一种三苯基膦‑壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束，采用两步酰胺法，将四羧丁基三苯基膦嫁接至壳聚糖硬脂酸嫁接物，得具有线粒体靶向功能的三苯基膦‑壳聚糖硬脂酸嫁接物，通过透析法包封抗肿瘤药物阿霉素，得线粒体靶向三苯基膦‑壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。本发明专利技术提供的载药胶束具备线粒体高效靶向的功能，经过包封的药物阿霉素，可最大限度降低阿霉素在正常组织及非靶部位的泄露，降低其毒副作用，同时准确的将阿霉素大量靶向输送至肿瘤细胞线粒体，增加阿霉素在肿瘤细胞线粒体的浓度，诱导肿瘤细胞凋亡，大幅度提高抗肿瘤疗效。

The preparation and application of three phenyl phosphine stearic acid grafted chitosan oligosaccharide micelles and preparation

The invention provides a three phenyl phosphine stearic acid grafted chitosan oligosaccharide micelles, using two step method four amide, carboxyl - three phenyl phosphine grafted to chitosan grafted stearic acid, with the mitochondrial targeting function of three phenyl phosphonic chitosan grafted stearic acid, through the dialysis bag method letter of doxorubicin, to mitochondrial targeting three phenyl phosphine stearic acid grafted chitosan oligosaccharide micelles. The drug loaded micelles provided by the invention has the function of mitochondrial efficient targeting, after drug doxorubicin encapsulated, can minimize the leakage of adriamycin in normal tissues and non target sites and reduce the side effect, at the same time accurate targeted delivery to a large number of the adriamycin induced tumor cell mitochondria, increase the concentration of adriamycin in tumor cells mitochondria, inducing apoptosis of tumor cells, greatly enhance the antitumor effect.

【技术实现步骤摘要】
三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束及制备与应用
本专利技术属制药领域，涉及线粒体靶向给药系统的构建，尤其涉及一种线粒体靶向三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的构建及其在抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
癌症有六大特征其包括：无限增殖潜力，对生长抑制信号的不敏感，凋亡的抑制，持续的增殖信号，诱导血管的发生，通过毛细血管壁和基底膜的侵袭和转移到其他位置。由于癌细胞是正常细胞突变，具有杀死癌细胞潜力的化学治疗剂也对正常组织产生非特异性毒性。药物分子主要通过占位效应，作用于病灶细胞的受体、酶、离子通道。近年来，与药理作用相关的信号通路调控，也开始成为药物作用候选位点。病灶细胞的细胞膜，胞浆中的线粒体、内质网，细胞核及核膜等亚细胞结构，是药物分子的主要作用位点。受药物分子自身理化性质的限制，能够进入到作用位点的药物分子数量非常有限，是导致现有药物毒副作用大、疗效低的主因。药物递释系统有可能将药物直接递释到其分子作用位点，提高靶点部位药物浓度，进而大幅度提高疗效。与传统药物递释系统相比，针对含药物分子作用位点的亚细胞结构靶向药物递释系统已成为解决上述难题的关键。线粒体功能障碍与癌细胞有很大的相关性，包括其无限增殖潜力，细胞凋亡受损，对抗生长信号的不敏感，增强的合成代谢和减少的自噬。由于线粒体介导细胞凋亡在细胞死亡中扮演重要作用，线粒体是诱导肿瘤细胞凋亡的重要靶点。通过分子靶向技术，将促凋亡药物输送至肿瘤细胞线粒体，可大幅度提高药物疗效与安全性。因此设计触发肿瘤细胞凋亡的线粒体靶向给药系统可能是有希望的癌症治疗策略。充分的亲脂性与离域正电荷结合是线粒体靶向的先决条件。线粒体通过氧化磷酸化途径在其脂双层中保持约-180至-200mV的恒定膜电位。这种高的负膜电位在其他任何细胞器中都不存在的，这为亲脂阳离子提供了选择性积累地条件。包括四羧丁基三苯基膦，三苯基膦，罗丹明123，氟吡啶和蒽环类在内的各种亲脂性阳离子已证实在细胞内递送时，在线粒体中有选择性的积累。为降低脱靶效应，较好的抑制肿瘤细胞增长，靶向肿瘤细胞线粒体诱导凋亡成为重中之重。将线粒体靶向与胶束给药系统结合，一方面诱导肿瘤细胞凋亡，另一方面减少药物本身的副作用，可大幅度提高抗肿瘤疗效。由两亲嵌段共聚物分子在水性介质中自聚集形成的聚合物胶束，是传递药物的新型纳米给药载体。因其具有一些特有的药物载体性质，如粒径小，在体内、外具有良好的稳定性和生物相容性，药物的控制释放以及生物膜通透性等特性，被认为是一种具有广阔前景的新型靶向给药系统。聚合物胶束通过“增强渗透与保留作用”，被动靶向肿瘤部位。壳聚糖硬脂酸嫁接物是由聚阳离子天然高分子材料壳聚糖经脂肪酸修饰后所得，该嫁接物在水性介质中可通过自组装形成嫁接物胶束，具有快速的肿瘤细胞摄取功能。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的制备方法，其中壳聚糖的分子量为19kDa，脂肪酸的碳链长度为十八碳，壳聚糖的脱乙酰度为95％，氨基取代度为18.0～20.7％，三苯基膦的修饰比例为1.2～3.9％。其具有代表性的化学结构通式为：通过以下制备步骤实现：(1)根据专利技术专利ZL200610051601.0提供的方法合成壳聚糖硬脂酸嫁接物：取分子量为19kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20mg/ml溶液。另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6：1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min。然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000Da的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。(2)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成取四羧丁基三苯基膦，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10mg/ml溶液。另按碳二亚胺：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为3：1取碳二亚胺，按N-羟基琥珀酰亚胺：四羧丁基三苯基膦摩尔比为3：1取N-羟基琥珀酰亚胺，加入上述溶液中，活化2小时，得反应液1。按氨基聚乙二醇2000：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为1：1取氨基聚乙二醇2000，溶于少量无水二甲亚砜中，加入到反应液1中，室温搅拌9小时，得反应液2。于反应液2中加入与氨基聚乙二醇2000摩尔比为1：1的二琥珀酰亚胺，室温搅拌12小时，得反应液3。按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为5：1～20：1取壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于少量去离子水中。将反应液3加入壳聚糖硬脂酸嫁接物水溶液中，室温搅拌24小时。将终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48小时后冷冻干燥，得三苯基膦-壳聚糖硬脂酸(固体粉末)。合成路线为：合成路线其中，1)为碳二亚胺(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的活化，2)为氨基-聚乙二醇2000的结构式，3)为二琥珀酰亚胺的结构式，4)为壳聚糖硬脂酸的结构式本专利技术所使用的壳聚糖脂肪酸嫁接物已为国家专利技术专利“荧光标记疏水改性壳聚糖聚合物及制备方法和应用”(专利号：ZL2005100507981)；和“表面修饰疏水改性壳聚糖聚合物给药胶团及其制备方法”(专利号：ZL200610051601.0)所涵盖。壳聚糖脂肪酸嫁接物中壳聚糖的分子量19kDa；脂肪酸的碳链长度为十八碳；壳聚糖的脱乙酰度为95％；氨基取代度为16.8％。本专利技术的第二个目的是提供一种三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的构建方法，载有的药物为阿霉素，通过以下方案实现：(1)碱基阿霉素制备：称取盐酸阿霉素200mg，溶于20mL二甲基亚砜中，加入三乙胺，盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1:2，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时，收集透析袋中产物，于8000r下离心10min，收集沉淀，用水溶解，重复三次以除去残留的盐酸阿霉素，冷冻干燥，得碱基阿霉素；(2)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备:称取三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为400w，工作2s停3s，制备2mg/mL的嫁接物胶束溶液。另取碱基阿霉素，加入二甲基亚砜，配成浓度为2mg/mL的溶液。按阿霉素:嫁接物的质量比为5％～15％的投药量加入含2mg/mL阿霉素的二甲亚砜溶液，在室温下避光搅拌2小时，反应结束后转移到截留分子量为3500的透析袋中，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000r下低温离心10min，以除去未被嫁接物胶束包封的阿霉素，收集上清液，得三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。本专利技术的第三个目的是提供一种三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束在制备线粒体靶向抗肿瘤药物中的应用。研究显示，三苯基膦修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物具有高效的线粒体靶向能力，且三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束具有显著的抗肿瘤活性。本专利技术提供一种三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束，采用两步酰胺法，将四羧丁基三苯基膦嫁接至壳聚糖硬脂酸嫁接物，得具有线粒体靶向功能的三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物，通过透析法包封抗肿瘤药物阿霉素，得线粒体靶向三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。本专利技术提供的载药胶束具备线粒体高效靶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三苯基膦‑壳聚糖硬脂酸嫁接物的制备方法，其中壳聚糖的分子量为19kDa，脂肪酸的碳链长度为十八碳，壳聚糖的脱乙酰度为95％，氨基取代度为18.0～20.7％，三苯基膦的修饰比例为1.2～3.9％，其具有代表性的化学结构通式为：

【技术特征摘要】
1.一种三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的制备方法，其中壳聚糖的分子量为19kDa，脂肪酸的碳链长度为十八碳，壳聚糖的脱乙酰度为95％，氨基取代度为18.0～20.7％，三苯基膦的修饰比例为1.2～3.9％，其具有代表性的化学结构通式为：其特征在于，通过以下步骤实现：(1)合成壳聚糖硬脂酸嫁接物：取分子量为19kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20mg/ml溶液。另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6：1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min。然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000Da的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物；(2)三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成取四羧丁基三苯基膦，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10mg/ml溶液，另按碳二亚胺：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为3：1取碳二亚胺，按N-羟基琥珀酰亚胺：四羧丁基三苯基膦摩尔比为3：1取N-羟基琥珀酰亚胺，加入上述溶液中，活化2小时，得反应液1，按氨基聚乙二醇2000：四羧丁基三苯基膦的摩尔比为1：1取氨基聚乙二醇2000，溶于...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡富强，孟廷廷，袁弘，谭亚南，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33