一种重组高分子型MBL及其制备方法与应用技术

一种重组高分子型ＭＢＬ，是由ｐＭＳＧ－ＭＢＬ转化宿主细胞系后表达得到的寡聚体ＭＢＬ。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种重组MBL及其制备方法与应用，特别涉及一种重组高分子型MBL及其制备方法与应用。
技术介绍
MBL(mannose binding lectin，甘露糖结合凝集素)是涉及先天免疫的血清蛋白。其分子量为32KD，包括羧基末端糖结合域(CRD)，胶原蛋白域和氨基末端富半胱氨酸区。三个MBL分子的胶原蛋白域形成三股螺旋，导致形成三聚体，三聚体的六个单元通过氨基末端半胱氨酸的分子内二硫键形成大分子。MBL可与其它蛋白缔合，如MBL相关丝氨酸蛋白酶(MASP 1，MASP 2，或MASP 3)或MBL相关蛋白(Map19)。MBL的整个分子形状与补体系统的第一组分(C1q)相似。活性MBL的功能也与C1q相似，但是，与C1q不同的是，它通过裂解C4和C2激活补体系统。MBL的活化需要在它们的表面蛋白上结合具有独特糖基化模式的微生物。在该过程中，MBL相关丝氨酸蛋白酶被激活，且C4和C2以相同方式被裂解，使得C1q相关丝氨酸蛋白酶(C1r和C1s)通过裂解C3触发补体系统而激活。与微生物结合的MBL也有助于微生物的有效吞噬作用，就好像MBL是调理素。目前，MBL基因已经被表达在各种细胞系中，包括CHO细胞(Katsuki Ohtani，etal.J.of Immunol.Methods 222，135-144，1999)或HLF肝癌细胞系或HEK 293 EBNA细胞系(T.Vorup-Jensen，etal.International Immunopharmacology 1，677-687，2001)。在CHO细胞系中，高产率表达是可能的，但回收的MBL主要是单体和二聚体，没有显著量的寡聚体。MBL基因在转化的人细胞系中的表达产生了明显更多的寡聚体，但总产率低于1μg/mL培养基。只有高分子量形式的MBL复合物能激活补体系统。补体系统的激活对于抵御微生物感染是非常重要的。它不仅为侵入微生物的有效吞噬和直接裂解做准备，而且有助于有效诱导适应性免疫。到目前为止，还没有人为处理微生物感染的病人而调动补体系统的尝试。血清中MBL的水平在不同个体上变化很大，范围在50ng/mL或更低到超过3μg/mL血清之间变化，这主要是由于遗传性变异。遗传性变异包括外显子上的点突变和启动子区突变。通常低水平MBL的个体易受微生物感染。尤其是，那些具有低水平MBL的新生婴儿会非常危险地受微生物感染。根据一项调查(Y.Hakozaki，etal.Liver，22，29-34，2002)，由于乙型肝炎病毒感染而经受肝功能衰竭的病人的死亡率依赖于MBL的血清水平。高水平MBL(3μg/mL)的病人不会死亡，而80％的低MBL水平的病人会死亡。因此，那些低MBL水平的个体可能因MBL补充而受益。本专利技术的专利技术人已经构建了一个重组酵母细胞系，其可以产生乙型肝炎病毒包膜蛋白的pre-S区(PCT/韩国专利申请号02/00820；中国专利03102363.0)。专利技术创造内容本专利技术的目的是提供一种用于治疗病毒、细菌或真菌感染的重组高分子型MBL。本专利技术所提供的重组高分子型MBL，是由pMSG-MBL转化宿主细胞系后表达得到的寡聚体MBL。其中，pMSG-MBL是从pMSG(韩国专利KCCM 10202)DNA序列构建的，该序列包括β-球蛋白序列的核基质附着体区域成分，SV40聚腺苷酸，胃泌素基因和MBL cDNA的转录终止序列。MBL cDNA是用PCR方法从人肝脏cDNA文库制备的。宿主细胞系是动物细胞；优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人肝细胞，和/或人胚肾(HEK)细胞；最优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。本专利技术的第二个目的是提供一种制备重组高分子型MBL的方法。本专利技术所提供的制备重组高分子型MBL的方法，是用pMSG-MBL转化宿主细胞系，被转化的宿主细胞系经培养筛选出重组高分子型MBL表达克隆，得到重组高分子型MBL。其中，宿主细胞系是动物细胞，优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人肝细胞，和/或人胚肾(HEK)细胞。宿主细胞系的培养方法包括悬浮培养、将细胞固定在培养烧瓶或瓶子或生物反应器上培养等。所筛选出的重组高分子型MBL表达克隆是CHO MBL/D1-3 KCTC 10472BP。所述CHOMBL/D1-3是通过在培养基中加入增量氨甲喋呤(MTX)选择得到的。本专利技术还提供了纯化重组高分子型MBL的方法。可以使用重组pre S或任何其它糖基化蛋白纯化重组高分子型MBL。例如，首先将重组pre S(recombinant pre S fromYeast，patent；PCT/KR02/00820)固定在适当的柱基质上，接着装柱，然后用适当的缓冲液平衡该柱，最后在存在钙离子的情况下将带有重组高分子型MBL的培养基加样到该柱上，用含有EDTA或EGTA的缓冲液洗脱重组高分子型MBL。该柱基质可以是任何合适的基质，例如琼脂糖。该柱的平衡可以用提供重组高分子型MBL与pre S的最佳结合的缓冲液进行。该缓冲液所含钙离子的范围在2mM-20mM之间。该被纯化的重组高分子型MBL的来源可以是人血清或任何其它含有重组高分子型MBL的物质，如CHO MBL/D1-3的培养基。从柱上洗脱重组高分子型MBL可以用任何含有EDTA或EGTA的溶液进行，其中所述溶液所含EDTA或EGTA的浓度范围在5mM-10mM之间。如果有必要，可以重复该亲和柱步骤。本专利技术的第三个目的是提供重组高分子型MBL的两种用途。本专利技术所提供的重组高分子型MBL第一种用途是以纯化的重组高分子型MBL为活性成分治疗微生物(如SARS病毒)感染和/或增强零或低水平血清MBL的个体免疫力的药物。该药物可以包括水，缓冲液，和/或稳定剂。稳定剂包括3％到30％的至少一种下述物质甘油，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，海藻糖，麦芽糖，白蛋白，和氨基酸。该药物还可以包括MBL缔合蛋白，如MASP 1，MASP 2，MASP 3，和/或Map19。这些MBL缔合蛋白可以是天然源或重组蛋白。该药物可以是油悬浮液、溶液或固体形式。如该药物为固体，可以在给药之前将该药物溶解于上述溶液(具体为哪些溶液)中。该药物的给药途径可以是腹腔注射，皮下腹腔注射，肌肉注射或静脉内注射或一个组合方法。上述药物的建议用量一般为0.2-0.5mg/kg/day疗程为15至30天。本专利技术所提供的重组高分子型MBL的第二种用途是作为补体激活触发物。本专利技术所提供的补体激活触发物是以重组高分子型MBL为活性成分的复合物。该复合物是可通过pre S或任何与MBL结合的糖基化蛋白或肽或甘露糖包被在脂质体或PLGA纳米颗粒上，然后再与重组高分子型MBL结合得到的。该复合物优选为重组高分子型MBL-pre S-PLGA复合物，它是通过包被有pre-S的PLGA纳米颗粒结合重组高分子型MBL得到的，且在存在无MBL的血清的情况下激活补体。纳该米颗粒的直径在10nM-10μM之间。该补体激活触发物可以被广泛地用于治疗微生物如病毒、细菌和/或真菌感染。本专利技术的重组高分子型MBL与从人血清纯化的天然MBL相似，表现出高分子量多聚体型。而且，本专利技术的CHO细胞系尤其是CHO MBL/D1-3产生了大量功能性MBL，这使得将该克隆用于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：文洪模，
申请(专利权)人：文洪模，阮北耀，仪忠军，
类型：发明
国别省市：