能够表达结构HCV抗原的重组MVA制造技术

本发明专利技术涉及重组ＭＶＡ，它能够表达结构ＨＣＶ抗原、所述结构抗原的功能性部分或所述结构抗原的表位。此外，本发明专利技术尤其描述了一种以疫苗形式存在的药物组合物，和本发明专利技术的重组ＭＶＡ，包含本发明专利技术重组ＭＶＡ的真核细胞，以及该重组ＭＶＡ的不同应用，如，用于制备重组结构蛋白、用于制备药物组合物，该药物组合物特别适用于治疗和预防ＨＩＶ感染以及由ＨＩＶ引起的疾病。本发明专利技术进一步涉及制备重组ＭＶＡ的方法，以及制备由所述的重组ＭＶＡ和重组ＭＶＡ的ＤＮＡ或ＲＮＡ编码的重组结构ＨＣＶ多肽的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组MVA，它能够表达结构HCV抗原、所述结构抗原的功能性部分或所述结构抗原的表位。此外，本专利技术尤其描述了一种以疫苗形式存在的药物组合物，和本专利技术的重组MVA，包含本专利技术重组MVA的真核细胞，以及该重组MVA的不同应用，如，用于制备重组结构蛋白、用于制备药物组合物，该药物组合物特别适用于治疗和预防HIV感染以及由HIV引起的疾病；以及制备本专利技术的重组MVA、由所述的重组MVA和重组MVA的DNA或RNA编码的重组结构HCV多肽的方法。
技术介绍
丙型肝炎病毒(HCV)其是一种属于Flaviviridaae家族的正链RNA病毒。它是人群中由于输血引发的非A-、非B-型肝炎的主要介质(8，35)。超过70％的感染病人可能发展为慢性肝炎，并进一步发展为肝硬化和肝细胞肿瘤(30，53)。目前的治疗方法很有限(39，40，31，24，13)。已经在疫苗的研发上进行了很多努力，并且取得了一些令人鼓舞的成绩(9，41，22，25)，但迄今为止还没得到有效的和/或治疗的疫苗。结构HCV蛋白，例如病毒包衣蛋白核(viral capside protein nucleus)、以及外壳糖蛋白(envelope glycoprotein)E1和E2是有希望的疫苗靶位在不同的HCV基因型和亚型中核心抗原高度保守(6)。在诸如Rabies病毒、乙型肝炎病毒和流感病毒等不同的模型中，核壳体(nucleocapsid)等内部抗原(internal antigen)都与保护免疫反应相关联。采用下述的不同方法可诱导并检测HCV核特异性的抗体和CTL反应(22，23)。相比之下，核心蛋白似乎具有许多调节功能，这些功能与宿主细胞的凋亡、转录、转化和免疫呈递等的调节相关(43，4)。采用重组E1和E2蛋白免疫黑猩猩能诱导对同源蛋白的免疫保护，推测这是通过诱导中和抗体来起作用的(9)。根据多篇报道，存在于E2的N-末端的高度可变区(HVR)可以是重要的中和位点(20，34，67，68)。由于缺少合适的动物模型，从而使得针对HCV的宿主免疫反应以及对疫苗保护的评价等研究变得很复杂。由于缺少有效的体外细胞培养系统来进行HCV扩增，并且在感染的肝组织或血液中HCV颗粒的数量很少，因此阻碍了对传统的诸如减毒或灭活病毒疫苗的形成及评价。基于活载体病毒表达抗原编码序列的原理，在HCV疫苗的开发中采用载体疫苗是一种新的替代途径。本专利技术的目的在于提供一种适于人和动物预防及治疗HCV感染的新的制剂，该制剂能够避免上述的缺点。根据本专利技术，该目的是通过重组MVA来完成的，所述MVA通过修饰能够表达结构HCV抗原、结构HCV抗原的功能性部分和/或所述HCV结构抗原的表位，优选表面表位。本专利技术的优选实施例可参考下述说明书以及所述的权利要求。根据本专利技术，具有编码结构HCV抗原、结构HCV抗原功能性部分或所述结构HCV抗原表位的DNA序列的重组MVA非常适用于制备疫苗。尤其令人惊奇的是，HCV核心抗原的制备或共同制备(co-production)并不影响疫苗的免疫原性。准确地，出版物(19)显示，在受感染的或接种疫苗的宿主中，免疫反应通过一种特别的方式受到抑制，即，通过牛痘病毒的复制来抑制。因此，可以设想，当使用MVA作为制备结构HCV抗原的载体时，也会发生这种抑制。然而文中显示，令人预料不到的是，当使用MVA载体时，所述免疫抑制再次得到补偿。所报道的这一令人惊奇的实验结果为开发新疫苗提供了良好的基础，尤其是在将HCV抗原作为疫苗抗原提供了基础。本专利技术所用的病毒载体是基于改良的安卡拉牛痘病毒(vaccinia virusAnkara，MVA)，该病毒是一种高度减毒(attenuated)的牛痘病毒株，已证实该病毒在临床应用是很安全的，这很可能是由于它的复制缺陷(42，45，60，50)。重组MVA(rMVA)用作疫苗已经证实能刺激T-细胞和针对不同异种抗原的抗体反应，并且在人类的多种感染性疾病(包括流感、AIDS、麻疹、以及疟疾)的动物模型实验中都具有保护作用(61，3，27，52，15，59，1)。尽管实质上已经知道重组MVA在制备疫苗中的应用，但是疫苗与结构HCV抗原，也即HCV的核心抗原以及E1和E2的组合应用现今还少有应用。实际上HCV的结构抗原是已知的。其包括外壳蛋白核心、包膜糖蛋白E1和包膜糖蛋白E2。已知为制备疫苗不必完全表达HCV的结构抗原。实验人员也能够根据特定的实验步骤以及所需的结果而仅表达结构抗原的一部分，尤其是HCV结构抗原的功能性部分或者表位。例如，功能性部分包括结构HCV抗原的免疫原性部分。其实例包括C-末端核心蛋白区域(HCV多蛋白质的127-190位氨基酸)、HCV多蛋白质的220-371位氨基酸的E1蛋白区域、以及包含糖蛋白E2的N-末端的高度可变区的27个氨基酸(Rehermann &Chisari 2000，Curr Top.Microbiol.Immunol 242299-325，Penin et al.2001，J Virol 755703-5710)。结构抗原的功能性部分包括例如HCV核心蛋白的124个N-末端氨基酸(Kunkel et al.J.Virol 752119-2129，2001)，它足以用于病毒样的核衣壳颗粒的装配；以及跨膜结构域TMD-E1的350-370位氨基酸或者TMD-E2的717-740位氨基酸，它对包膜蛋白E1和E2的异质二聚化(heterodimerisation)是非常必要的(Op de Beeck et al.2000，J.Biol.Chem.27531428-31437)；或者糖蛋白的可分泌型，它能够穿过内质网。优选地，这是通过缺失或其它突变来改变E1或E2的跨膜结构域来完成的，从而使得蛋白质不再保留在膜上(Michalak et al.1997，J Gen Virol 782299-2306)。结构HCV抗原的表位是已知的。这些表位包括诸如MHC-I限制性T-细胞核心氨基酸2-10，核心氨基酸35-44，核心氨基酸41-49，核心氨基酸85-98，核心氨基酸132-140，核心氨基酸167-176，核心氨基酸178-187，核心氨基酸181-190，E1氨基酸220-227，E1氨基酸233-242，E1氨基酸363-371，E2氨基酸401-411，E2氨基酸489-496，E2氨基酸521-628或者E2氨基酸725-733(Rehermann & Chisari 2000，Curr Top Microbiol Immunol242299-325)。进一步的例子包括E1表位氨基酸312-326。结构HCV抗原的表位还可以利用已知的技术来确定，例如在Koziel et al 1995，J.ClinInvest 962311-2321中所述。在本专利技术的一个优选实施方案中，重组MVA包括编码E1和E2的DNA序列。特别有利的是可以采用E1抗原与E2抗原的截短形式(truncated form)的组合，从而使得两种抗原能够共同制备。“截短”表示E2糖蛋白的亲脂性部分缺失。本实施方案已经表明，与表达E1抗原和全部E2蛋白的重组MVA疫苗接种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组ＭＶＡ，其特征在于，它包含编码ＨＣＶ结构抗原或者编码ＨＣＶ结构抗原的功能性部分或表位的ＤＮＡ序列。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：格尔德祖特尔，福尔克尔艾尔弗勒，卡罗琳施泰布，王圆，李光弟，朱立新，
申请(专利权)人：GSF环境及健康研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]