人单核吞噬白细胞的制备方法技术

一种制备人单核吞噬白细胞的方法，所述方法包括将从个体血样中分离的单核细胞与来自同一个体的皮肤组织一起培养，去除所述培养混合物中的真皮部分，通过离心将所获得的活化单核吞噬白细胞沉淀，洗涤所述活化巨噬白细胞并将其重悬于所述培养基中，然后评价所述培养物对人体给药的适应性。细胞治疗制品用所得培养物进行制备，并且用于促进ＣＮＳ轴突再生、伤口愈合和治疗心肌梗塞。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

和专利技术背景本专利技术涉及一种制备人单核吞噬白细胞的方法、由此获得的细胞培养物及其应用。受伤组织愈合是基于许多分子和生理因子间同步相互作用的复杂自然过程。有效的炎症反应是诱导受伤组织再生和修复的主要因素之一。这是组织再生能力的最早最重要的反应之一。募集并进一步在原位活化的巨噬细胞是有效炎症反应初期的关键因子。炎症反应是体内所有组织伤口愈合的组成部分。在轴突损伤后，哺乳动物周围神经系统(PNS)的神经元比中枢神经系统(CNS)在轴突再生方面具有更大能力，已表明巨噬细胞在PNS轴突再生中起到关键作用(Schwartz等，1989，FASEB J.，32371-2378)。哺乳动物的CNS显示出在轴突损伤后轴突再生能力差。CNS轴突再生和PNS轴突再生间的差异似乎主要是因为神经元的细胞环境，而不是神经元本身。在神经元损伤后，围绕着PNS神经元的神经膜细胞受到调节，从而变成容许或支持轴突再生，而围绕着CNS神经元的星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞不显示出这样的调节并保持不支持或抑制轴突再生。损伤后炎症反应的差异与这种调节缺乏相关。特别是，与响应PNS的损伤相比，响应CNS损伤的单核吞噬细胞的积累被延迟并受到限制。在CNS中，炎症反应的降低，至少部分是由于居留的组织巨噬细胞(小胶质细胞)的相对无效性所致。血源性单核细胞不能进入CNS，不能象它们在任何其它受损伤的需要伤口愈合的组织中那样发挥正常作用，这进一步强化了这种不足。在美国专利第5,800,812号、第6,117,424号和第6,267,955号中，已公开了使用同种异体单核吞噬细胞以促使哺乳动物的CNS中轴突再生的方法和组合物，所有这些专利全都属于本申请的同一申请人，其每个及所有这些专利都通过引用结合到本文中，视同全部在此公开。这些专利描述了从成年Sprague-Dawley大鼠外周血中分离和培养单核细胞的方法，以及经与同系大鼠坐骨神经或视神经段共培养、或在适合同系大鼠坐骨神经或视神经的培养基中培养而刺激分离的单核细胞的方法。然后分析受刺激的单核细胞的吞噬活性和/或一氧化氮产量，并且在经受视神经横切的大鼠的伤口上或伤口附近给予受刺激的单核细胞。专利技术概述本专利技术的一个目的是提供一种用于制备人单核吞噬白细胞的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种用于制备这样的表达伤口愈合表型的人单核吞噬白细胞的方法。本专利技术的再一个目的是提供一种用于制备这样的表达伤口愈合表型并适合于促进轴突再生(例如在脊髓损伤的病例中)的人单核吞噬白细胞的方法。本专利技术的又一个目的是提供一种用于制备这样的表达伤口愈合表型并适合于皮肤伤口(特别是慢性皮肤溃疡)愈合的人单核吞噬白细胞的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种用于制备这样的表达伤口愈合表型并适合于减少坏死组织的体积(例如在心肌梗塞的病例中)的人单核吞噬白细胞的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种描述通过本专利技术方法产生的这样的表达伤口愈合表型的人单核吞噬白细胞的特征的方法。本专利技术的这些和其它目的由以下方法提供其中从个体血液中分离出单核细胞，将其悬浮于适合于培养单核细胞的培养基中，然后与组织工程皮肤或与从同一个体切取的皮肤组织(优选真皮)一起培养，然后去除所述皮肤组织，洗涤巨噬细胞，然后将所得活化单核吞噬白细胞重悬于与前述相同的合适培养基中。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述人单核吞噬白细胞是自体的，也就是说，从个体外周血液单核细胞制备它们并与同一个体的皮肤组织一起活化，然后给予所述同一个体。本专利技术还提供用于促进CNS中轴突再生(特别是CNS损伤后)、伤口愈合和减少心肌梗塞坏死组织的细胞治疗制剂。附图简述附图说明图1A-1B分别是非颗粒型单核细胞(培养前)和颗粒型单核吞噬白细胞(培养后)的照片。专利技术详述吞噬细胞定义为能够摄取颗粒物质如微生物和其它调理颗粒抗原的细胞，包括诸如巨噬细胞和单核细胞的细胞。单核细胞是单核吞噬白细胞。单核细胞是从骨髓造血细胞的幼单核细胞形成，进入血液，循环至多72小时，随后进入组织例如肺、肝、和患病组织例如恶性肿瘤和动脉粥样斑块，在此它们变为巨噬细胞。单核细胞分化为巨噬细胞涉及许多变化形态学变化，体积增大，吞噬活性增加、表达细胞标记，分解酶水平更高和分泌多种可溶性因子。巨噬细胞分散在全身。有些居留在特定组织，变为固定巨噬细胞，而另一些保持游动，被称为游离巨噬细胞。虽然正常时处于静止状态，但巨噬细胞被多种刺激以免疫应答程序激活。颗粒抗原的吞噬作用是原始激活刺激。然而，由活化T辅助(TH)细胞分泌的细胞因子(例如干扰素-γ)、炎症反应介质和细菌细胞壁产物都可进一步增强巨噬细胞活性。单核细胞是参与炎性过程的第一类细胞。它们有大量任务，其活性程度可能使它们行使其职责。单核细胞活化过程不是一个全或无现象，而是渐进的刺激物特异性效应。单核细胞/巨噬细胞的许多功能与其活化程度直接相关，包括免疫功能、分泌功能、吞噬功能和其它功能。按照其活化程度，通常将巨噬细胞定义为以下三个不同的组(i)伤口愈合巨噬细胞，其主要功能是作为炎症反应的第一岗哨；(ii)抗微生物和细胞毒性巨噬细胞，其主要功能是作为抵抗致病生物和恶性肿瘤细胞的体内防御机制；和(iii)抗原呈递巨噬细胞，特别是TH细胞，在其功能中，它们帮助细胞参与任何炎症反应。本申请所用的术语“单核吞噬白细胞”、“单核白细胞”、“单核吞噬细胞”和“巨噬细胞”可互换使用，是指用本专利技术方法制备的细胞。在一个实施方案中，本专利技术提供一种用于制备人单核吞噬白细胞的方法，所述方法包括(i)从个体血样中分离单核细胞，然后将所述单核细胞悬浮于合适培养基(在本文称为“培养基”)中；(ii)处理来自同一个体的皮肤组织，去除表皮，将真皮部分在含有抗生素的培养基中进行超声处理，将经超声处理的真皮部分浸泡在含有抗生素的新鲜培养基中，然后用不含抗生素的新鲜培养基冲洗；(iii)将步骤(i)的单核细胞与冲洗的步骤(ii)的真皮部分共培养；(iv)去除所述培养混合物中的真皮部分，通过离心沉淀所得活化单核吞噬白细胞；(v)洗涤所述活化单核吞噬白细胞并重悬于所述培养基中；和(vi)评价所述培养物对人体给药的适应性。在步骤(i)中，所述人单核细胞可通过任何常规方法从血样中分离出来。在一个实施方案中，单核细胞的分离方法包括下述步骤(a)稀释血液；(b)通过将步骤(a)稀释的血液铺在菲可(Ficoll)上再通过离心分离所述单核细胞部分；(c)洗涤步骤(b)分离的细胞并通过在珀可(Percoll)上进行密度梯度离心而进一步分离；和(d)洗涤步骤(c)的分离的富含单核细胞的部分并将所述细胞悬浮于合适培养基中。可用磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行上述步骤(a)的全血稀释和步骤(c)和步骤(d)的细胞洗涤，然后可将上述步骤(d)的富含单核细胞的部分悬浮于合适培养基中。本文所用的术语“合适培养基”是指适合于培养单核细胞的培养基，例如但不限于Iscove氏改良Dulbecco培养基(IMDM)和RPMI1640。对所述单核细胞和所述皮肤组织的处理均在该同一合适培养基中进行。在人单核吞噬白细胞制备方法的步骤(ii)中，可以通过下述步骤来处理人皮肤组织将来自同一个体的皮肤组织进行冷冻，解冻后将所述皮肤组织浸泡在由合适培养基(如IMDM或RP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备人单核吞噬白细胞的方法，所述方法包括：（ｉ）从个体血样中分离单核细胞，然后将所述单核细胞悬浮于合适培养基中，所述合适培养基在本文称为“培养基”；（ｉｉ）处理来自同一个体的皮肤组织，去除表皮，将真皮部分在含有抗生素的培养基中进行超声处理，将所述经超声处理的真皮部分浸泡在含有抗生素的新鲜培养基中，然后用不含抗生素的新鲜培养基冲洗；（ｉｉｉ）将步骤（ｉ）的单核细胞与步骤（ｉｉ）的经冲洗的真皮部分共培养；（ｉｖ）去除所述培养混合物中的所述真皮部分，然后通过离心使所获得的活化单核吞噬白细胞沉淀；（ｖ）洗涤所述活化单核吞噬白细胞，然后将其重悬于所述培养基中；和（ｖｉ）评价所述培养物对人体给药的适应性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：V富尔加，R克莱纳巴基梅，I阿什，M埃申巴奇施瓦茨，
申请(专利权)人：耶达研究及发展有限公司，
类型：发明
国别省市：IL[以色列]