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一种鉴定蕲蛇的PCR方法技术

技术编号:17208586 阅读:40 留言:0更新日期:2018-02-07 20:50
本发明专利技术属于中药及中药材鉴定技术领域,特别涉及到一种能够特异鉴定蕲蛇的PCR方法及其特异引物。使用此方法鉴别蕲蛇的真伪,只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测即可完成对样品真伪的鉴别。主要用于蕲蛇药材、蕲蛇水提物、蕲蛇醇提物、极限(高温、高压、长时间)条件下蕲蛇提取物、中药制剂(多种同类提取物)以及极限(高温、高压、长时间)条件处理中药制剂(多种同类提取物)的快速鉴定。

A method of identifying Agkistrodon PCR

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定蕲蛇的PCR方法
本专利技术涉及中药及中药材、中药提取物鉴定
,特别是一种能够特异性鉴定金钱白花的PCR方法及其特异引物。主要用于蕲蛇药材、蕲蛇提取物、极限条件提取物,含有蕲蛇的制剂以及极限条件处理的蕲蛇制剂快速鉴定。
技术介绍
蕲蛇为中国药典(2015年版)一部收载的一种常用中药,来源于蟒科动物五步蛇AgkistrodonacutusGuenther的干燥体。有祛风,通络,止痉之功效。用于风湿顽痹,麻木拘挛,半身不遂,抽搐痉挛,破伤风,麻风,疥癣。蕲蛇作为贵重动物药材的临床功效确切,但商品来源复杂、药材形态鉴别困难,市场上流通的蕲蛇药材中,多以中介蝮蛇、山烙铁头、蟒蛇等经过加工后混作正品蕲蛇销售。这些品种与蕲蛇同科不同属,因其来源相近,造成鉴定困难。此外,药材在加工处理时剖去内脏后,要进行干燥处理,皮上的花纹特征、颜色变得模糊,使得辨别困难,如百花锦蛇、玉斑锦蛇、滑鼠蛇、眼镜蛇等其大小、形态特征与蕲蛇有相似之处,这也是造成鉴定困难的另一重要原因。国内虽已有PCR方法鉴定蕲蛇药材的报道,但鉴定极限条件处理后的药物制剂中蕲蛇的PCR方法至今未见报道。由于在制剂的生产过程中,存在粉碎、混合等环节,水煎煮提取、醇煎煮提取等工艺环节,甚至是高温高压等条件处理,这些条件要么使蕲蛇粉末变为混合物,要么使蕲蛇因提取过程而被破坏掉大量有机成分,使得制剂中蕲蛇的鉴定变得困难。而有的制剂使用多种蛇类药材,或者使用多种蛇类和非蛇类动物药材,使得其它几味蛇类药材或非蛇类动物药材也存在干扰鉴定的可能,因而使制剂中蕲蛇的鉴定变得十分困难。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于鉴定蕲蛇药材、蕲蛇提取物、极限提取物以及含蕲蛇制剂、极限条件处理后的制剂的引物及鉴定方法,该PCR鉴定方法操作简单,能快速准确的鉴定蕲蛇粉末、提取物、极限提取物、混合制剂、甚至极限条件下处理的制剂。一对鉴定蕲蛇的特异引物:上游引物、下游引物,其序列为:上游引物:5’-TCCAAATCATAACCGGCTTCTTCTTG-3’下游引物:5’-AATTAAAAGGGTGGTGCCTGATAGTCAA-3’一种蕲蛇的PCR鉴定方法,包括以下步骤:分为以下四个步骤:1、制备样品:制备蕲蛇粉末、采用加热冷凝回流装置制备蕲蛇水提物、醇提物和高压制备极限条件提取物,混合得到几种同类药材粉末并采用加热冷凝装置制备混合水提物、醇提物,高压条件下制备极限条件下混合粉末、混合水提物、混合醇提物。2、样品DNA提取:从以上样品中提取DNA。3、PCR反应:采用PCR方法得到PCR产物,95℃5min,30个循环(95℃30s,64℃45s),72℃5min,得到扩增产物。4、以电泳鉴定扩增产物大小,以此鉴定蕲蛇真伪,通过实验验证方法的稳定性。方法:1.5%凝胶、130V电泳25min,在230bp处有单一条带,则确定所检材料为蕲蛇。附图说明图1为蕲蛇粉末和其他蛇类药材粉末的PCR鉴定结果,结果如图1所示,蕲蛇在230bp处有均一条带,而其他易混淆品没有条带说明该方法可区分蕲蛇粉末与易混淆品。M为Marker,从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp,1~3为蕲蛇粉末,4为乌梢蛇粉末,5为金钱白花蛇粉末,6为水。图2为蕲蛇水提物和醇提物的PCR鉴定结果。蕲蛇水提物、醇提物提取物均在230bp处有均一条带,说明该方法可鉴定蕲蛇的提取物。M为Marker,从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp,1为蕲蛇粉末,2为蕲蛇水提物,3为蕲蛇醇提物,4为乌梢蛇水提物,5为乌梢蛇醇提物,6金钱白花蛇水提物,7为金钱白花蛇醇提物。图3为极限(高温、高压、长时间)条件下蕲蛇水提物和醇提物的PCR鉴定结果。金钱白花蛇极限提取物均在230bp处有均一条带,说明该方法可鉴定金钱白花蛇的提取物。M为Marker,从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp,1为蕲蛇极限条件粉末,2为蕲蛇极限条件水提物,3为蕲蛇极限条件醇提物,4为乌梢蛇极限条件水提物,5为乌梢蛇极限条件醇提提物,6为金钱白花蛇极限条件水提物,7为金钱白花蛇极限条件醇提物。图4为几种同类药材混合粉末、混合水提物、混合醇提物、极限条件下混合粉末、混合水提物、混合醇提物鉴定结果。含有金钱白花蛇的制剂有条带,说明可以区分蕲蛇的真伪。M为Marker,从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp,1为多种同类药材混合粉末,2为混合水提物,3为混合醇提物,4为极限条件处理混合粉末,5为极限条件混合水提物,6为极限条件混合醇提物,7为乌梢蛇和金钱白花蛇混合粉末,8为乌梢蛇和金钱白花蛇混合水提物,9为乌梢蛇和金钱白花蛇混合醇提物,10为极限条件下乌梢蛇和金钱白花蛇混合粉末,11为极限条件乌梢蛇和金钱白花蛇混合水提物,12为极限条件乌梢蛇和金钱白花蛇混合醇提物。具体实施方法:1材料金钱白花蛇粉末、乌梢蛇粉末、蕲蛇粉末均由通化金马公司提供2特异引物上游引物:5’-TCCAAATCATAACCGGCTTCTTCTTG-3’下游引物:5’-AATTAAAAGGGTGGTGCCTGATAGTCAA-3’3样品DNA提取本专利技术采用的DNA提取方法为:取蕲蛇样品约0.1g至1.5mL离心管中,加入275μL消化液(细胞核裂解液200μL,0.5mol/LEDTA50μL,蛋白酶K(20mg/mL)20μL,RNA酶溶液5μL),55℃温育1h,加入250μLWizardSVLysisBuffer混匀,加到离心管柱中,10000r/min离心2分钟;弃掉过滤液,加入800μL洗脱液(醋酸钾162.8mmol/L,Tris-HCl(pH7.5)22.6mmol/L,EDTA(pH8.0)0.019mmol/L,60%乙醇),10000r/min离心1min;弃掉过滤液,用洗脱液反复洗脱3次,每次10000r/min离心1分钟;弃掉最后一次过滤液后再离心2min,将过滤柱转移入新的离心管中,加入100μLddH2O,室温放置2min后,10000r/min离心2min,滤液-20℃保存备用。4PCR反应表1PCR反应体系(25μL)反应条件:95℃5min,30个循环(95℃30s,64℃45s),72℃5min。5电泳检测配制含GelRed的1.5%琼脂糖凝胶,130V电泳25min,在凝胶在紫外透射仪上观察,产物应在230bp处有单一条带。本文档来自技高网...
一种鉴定蕲蛇的PCR方法

【技术保护点】
建立一种鉴定蕲蛇的方法:提取蕲蛇样品的DNA,通过PCR扩增、电泳检测等过程,鉴定蕲蛇及其提取物、极限条件提取物和制剂的真伪。

【技术特征摘要】
1.建立一种鉴定蕲蛇的方法:提取蕲蛇样品的DNA,通过PCR扩增、电泳检测等过程,鉴定蕲蛇及其提取物、极限条件提取物和制剂的真伪。2.权利1的特征在于可以鉴定混合制剂中蕲蛇的真伪,过程包括下列步骤:1)制备样品:蕲蛇粉末,蕲蛇水提物和醇提物、极限(高温、高压、长时间)条件提取的蕲蛇水提物和醇提物,蕲蛇与其他蛇类药材的混合制剂和极限(高温、高压、长时间)条件处理的蕲蛇与其他蛇类药材的混合制剂。2)样品DNA提取:从样品中提取DNA。3)PCR反应:采用PCR方法得到PCR产物,93~95℃5min,30~40个循环(95℃30~45s,55~65℃30~45s,72℃30~45s),72℃5min,得到扩增产物。4)电泳鉴定:根据扩增产物大小,鉴定蕲蛇真伪。3.权利2中样品:蕲蛇粉末,蕲蛇水提物和醇提物,极限条件提取的蕲蛇水提物和醇提物,蕲蛇混合制剂,极限条件处理的蕲蛇制剂:1)蕲蛇粉碎,得蕲蛇细粉。2)采用加热冷凝回流法提取,温度为100℃,料水比为1∶10,时...

【专利技术属性】
技术研发人员:周亚伟
申请(专利权)人:周亚伟
类型:发明
国别省市:北京,11

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