一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法技术

本发明专利技术公开一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法，以及磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用，所述磁性纳米颗粒呈分散状态，直径大小为5‑500nm，磁性纳米颗粒表面含有纳米孔、化学键或者电荷以吸附蛋白，通过磁场控制蛋白和细胞的沉淀以构建蛋白复合细胞膜片。本发明专利技术提出了磁控蛋白复合细胞膜片的概念和制备方法，蛋白质可被高效固载于细胞膜片中并发挥生物学效应，可显著提高体内再生修复效果，为体外构建复杂组织结构提供一种新方法。并提供了一种可控的、分散的、8‑12nm大小的nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒的制备方法，磁性纳米颗粒不仅可以被细胞吞噬而标记细胞，还可以吸附结合蛋白。

Preparation of a magnetic protein complex cell membrane

【技术实现步骤摘要】
一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法
本专利技术属于组织工程与再生医学领域，更具体地讲，涉及一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法，可用于组织再生修复和体外微组织构建及研究。
技术介绍
细胞膜片制备无需支架材料、通过细胞连接和细胞外基质构成一整体，更接近组织细胞的天然生理状态，该技术在干细胞为基础的再生治疗方面具有诸多优势。从制备方法来讲，传统的使用温敏型培养皿和直接诱导成膜技术存在培养周期长、细胞膜片厚度受限、多种细胞直接叠加困难等缺点，另外，温敏型培养皿价格较贵，也进一步限制了相关研究和应用。磁控技术制备细胞膜片周期更短、可反复叠加多种细胞制备超厚细胞膜片，并无需受温敏型培养皿的限制，更具优势。为了进一步提高再生修复效果，拟将具有不同生物活性的生长因子掺入细胞膜片中，构建磁控生长因子复合细胞膜片，该方面研究尚未见文献报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用。本专利技术的第二个目的在于提供一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法。本专利技术的第三个目的在于提供分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒的制备方法。为实现本专利技术第一个目的，本专利技术公开以下技术方案：磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用，其特征在于，所述磁性纳米颗粒呈分散状态，直径大小为5-500nm，磁性纳米颗粒表面可含有纳米孔、化学键或者电荷以吸附蛋白，通过磁场控制蛋白和细胞的沉淀以构建蛋白复合细胞膜片。作为一个优选方案，所述细胞是间充质干细胞、胚胎干细胞、iPS细胞或成体细胞，所述蛋白是生长因子、促进再生修复功能的其他蛋白质、多肽、外泌体、核酸或小分子药物。作为一个优选方案，细胞与1-100μg/mL所述磁性纳米颗粒共培养实现细胞吞噬标记；50-200μg/mL蛋白与1-100μg/mL所述磁性纳米颗粒孵育实现结合。作为一个优选方案，所述磁性纳米颗粒为分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4或介孔二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒mSiO2@Fe3O4。作为一个优选方案，所述分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4通过以下方法制备，首先采用金属离子切割方法获得60-120nm大小的氧化石墨烯，然后通过水热法制备分散的氧化石墨烯包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4，直径大小为8-12nm，所述金属离子包括Ag离子、Fe离子、Co离子、Ni离子、Ca离子和Ba离子。为实现本专利技术第二个目的，本专利技术公开以下技术方案：一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备呈分散状态，直径大小为5-500nm，表面含有纳米孔、化学键或者电荷的磁性纳米颗粒；(2)利用分散的磁性纳米颗粒分别标记细胞、结合蛋白，通过磁场控制二者沉淀以构建蛋白复合细胞膜片。作为一个优选方案，所述磁性纳米颗粒为分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4，通过以下方法制备，首先采用金属离子切割方法获得60-120nm大小的氧化石墨烯，然后通过水热法制备分散的氧化石墨烯包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4，直径大小为8-12nm，所述金属离子包括Ag离子、Fe离子、Co离子、Ni离子、Ca离子和Ba离子。为实现本专利技术第三个目的，本专利技术公开以下技术方案：分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4的制备方法，其特征在于，首先采用金属离子切割方法获得60-120nm大小的氧化石墨烯，然后通过水热法制备分散的氧化石墨烯包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4，直径大小为8-12nm，所述金属离子包括Ag离子、Fe离子、Co离子、Ni离子、Ca离子和Ba离子。本专利技术制备了nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒，并进行了系列表征；检测了牙髓干细胞(DPSCs)对nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒的吞噬行为，评估了细胞的生物活性；评价了nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒用于蛋白缓释的能力和效率；制备了BMP2蛋白复合的DPSCs细胞膜片，移植于体内观察骨再生效果。研究结果表明：(1)成功制备了平均直径大小为8-12nm的nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒，颗粒被覆氧化石墨烯外壳，仍具有较高的饱和磁化强度；(2)牙髓干细胞可快速吞噬nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒，细胞生存及增殖活性未受影响；(3)具有氧化石墨烯外壳的nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒可以快速结合蛋白(包括BMP2蛋白等生长因子)，蛋白结合量具有一定的浓度依赖性；(4)蛋白可在细胞膜片中均匀分布，在制备的BMP2蛋白复合的DPSCs细胞膜片中，BMP2蛋白可被大量固载，并可激活DPSCs的Smad1/5/8信号通路，促进体内骨再生。本专利技术的优点在于：本专利技术提出了磁控生长因子复合细胞膜片的概念和制备方法，生长因子可被高效固载于细胞膜片中并发挥生物学效应，可显著提高体内再生修复效果，为体外构建复杂组织结构提供一种新方法。并提供了一种可控的、分散的、8-12nm大小的nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒的制备方法，磁性纳米颗粒不仅可以被细胞吞噬而标记细胞，还可以吸附结合蛋白。附图说明图1：(a)nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒的制备过程；(b)Ag+切割后，氧化石墨烯碎片的AFM照片及高度图；(c)离心分离获得尺寸大小为60-120nm的氧化石墨烯碎片的AFM照片及高度图；(d)nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒的TEM照片；(e)放大观察nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒；(f)nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒的磁化强度，及磁颗粒受磁力作用从溶液中分离情况。图2：不同离子切割获得的氧化石墨烯颗粒的AFM照片。图3：(a)牙髓干细胞与不同浓度的nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒共培养2小时，普鲁士蓝染色观察细胞被标记情况，可见细胞内被染成蓝色的磁颗粒；(b)细胞凋亡流式细胞检测结果；(c)凋亡细胞所占百分比；(d)坏死细胞所占百分比；(e)MTT检测结果。图4：(a)磁控细胞膜片制备示意图；(b)通过改变磁铁组合图案精确控制细胞膜片形状；(c)通过分次添加不同细胞，可以获得分层复合细胞膜片；(d)通过单次添加细胞制备的具有均一厚度的细胞膜片，HE染色观察；(e)通过反复添加细胞，可以获得超厚细胞膜片，普鲁士蓝染色观察；(f)细胞膜片厚度统计结果(★★，p<0.01)。图5：(a)NIH3T3细胞与nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒共培养2小时，普鲁士蓝染色观察细胞被标记情况，也可见细胞内染成蓝色的磁颗粒；(b)受磁性纳米颗粒标记的细胞可以通过磁力控制形成特定形状的细胞膜片。图6：(a)红色荧光蛋白标记二抗(2Ab-PE)可以与nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒结合并被磁铁吸附；(b)通过磁场控制，2Ab-PE可被均匀放置于细胞膜片中；(c)随着蛋白浓度的提高，更多的BSA蛋白可被nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒结合。图7：(a)通过磁控颗粒可将大量BMP2蛋白添加至细胞膜片中，并可激活Smad1/5/8信号通路；(b)移植于裸鼠体内，免疫荧光结果示磁颗粒标记DPSCs被诱导分化为Osterix+成骨细胞；(c)裸鼠皮下埋植一个月，HE染色结果示成骨情况；(d)新骨面积统计结果(★★，p<0.01)。图8：(a)mSiO2@Fe3O4磁性纳米颗粒也能结合蛋白，本文档来自技高网...

【技术保护点】
磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用，其特征在于，所述磁性纳米颗粒呈分散状态，直径大小为5‑500nm，磁性纳米颗粒表面含有纳米孔、化学键或者电荷以吸附蛋白，通过磁场控制蛋白和细胞的沉淀以构建蛋白复合细胞膜片。

【技术特征摘要】
1.磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用，其特征在于，所述磁性纳米颗粒呈分散状态，直径大小为5-500nm，磁性纳米颗粒表面含有纳米孔、化学键或者电荷以吸附蛋白，通过磁场控制蛋白和细胞的沉淀以构建蛋白复合细胞膜片。2.根据权利要求1所述的磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用，其特征在于，所述细胞是间充质干细胞、胚胎干细胞、iPS细胞或成体细胞，所述蛋白是生长因子、促进再生修复功能的其他蛋白质、多肽、外泌体、核酸或小分子药物。3.根据权利要求1所述的磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用，其特征在于，细胞与1-100μg/mL所述磁性纳米颗粒共培养实现细胞吞噬标记；50-200μg/mL蛋白与1-100μg/mL所述磁性纳米颗粒孵育实现结合。4.根据权利要求1所述的磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4或介孔二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒mSiO2@Fe3O4。5.根据权利要求4所述的磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用，其特征在于，所述分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4通过以下方法制备，首先采用金属离子切割方法获得60-120nm大小的氧化石墨烯，然后通过水热法制备分散的氧化石墨...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋欣泉，张文杰，杨光正，王贤松，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31