在绿色植物和微生物中高水平生产对苯二酚葡糖苷制造技术

本发明专利技术涉及在遗传修饰过的绿色植物和微生物中生产氢醌葡糖苷的方法和材料。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及植物基因表达，分子生物学，和微生物学领域。提供了用于在遗传修饰过的绿色植物和微生物中以及体外生产氢醌葡糖苷(对苯二酚葡糖苷)的方法和材料。
技术介绍
对苯二酚葡糖苷(氢醌葡糖苷)及其糖苷配基氢醌是被用作皮肤增白剂的化合物。皮肤色素沉着主要是通过由黑素细胞产生的黑色素的数量决定地。导致黑色素形成的生物合成途径始于通过酪氨酸酶进行的酪氨酸向二羟基苯丙氨酸(DOPA)的转化(EC 1.14.18.1)。抑制酪氨酸酶，减少了通过黑素细胞产生的黑色素的数量，导致皮肤的脱色。业已证实了对苯二酚葡糖苷和对苯二酚葡糖苷的单酯衍生物能通过抑制酪氨酸酶减少由黑素细胞产生的黑色素的数量(US6306376)。氢醌和氢醌衍生物，如氢醌醚，也被用作脱色剂。不过，业已报道了使用这种化合物产生的不利的副作用。这些化合物具有很高的刺激性，并且对黑素细胞有毒(US 6306376)。将对苯二酚葡糖苷用作脱色剂比使用氢醌更优选，因为与糖苷配基相比，对苯二酚葡糖苷具有较低的毒性。业已报道了对苯二酚葡糖苷可以用作抗氧化剂，抗微生物剂，抗炎剂，并且可能用作致癌作用(黑素瘤)的抑制剂。不过，对苯二酚葡糖苷的商业化应用由于它的高成本而受到限制。还没有用于生产这种化合物的低成本的商业化生产方法。现有用于生产的方法包括化学合成(US 3201385；US 6388103；和JP 62-226974A)；从天然产生对苯二酚葡糖苷的植物中提取；使用微生物宿主或植物细胞培养物，种子或幼苗进行生物转化，这些材料适合表达葡糖基转移酶，让它们接触氢醌和UDP-葡萄糖(Arend等，Phytochemistry，53187-193(2000)；Arend等，Biotech.Bioeng.，76(2)126-131(2001)；Hefner等，Bioorg.Med.Chem.，101731-1741(2002)；和JP07224083A)，或通过类似的方法，其中，将葡萄糖和氢醌的混合物与β-葡糖苷酶接触(JP 05176785A)。化学合成不是生产对苯二酚葡糖苷的节省成本的方法。化学合成方法通常需要昂贵的原材料，各种昂贵并且有毒的溶剂和催化剂，大量的能量投入，以及随后用于去掉杂质的纯化步骤。对不可再生的资源的投入是昂贵的并且是对环境有害的。很多高等植物能天然产生对苯二酚葡糖苷。业已报道了杜鹃花科，蔷薇科，和虎耳草科的成员能以最高达20％干重量(叶片)的量产生对苯二酚葡糖苷。不过，这些植物具有差的农艺性状(Arend等，Phytochemistry，53187-193(2000))。在植物中进行对苯二酚葡糖苷的节省成本的生产，需要具有好的农艺性状并且具有完善的加工内别构造的作物品种。尽管存在多种生产对苯二酚葡糖苷的途径，将具有优良农艺性状的绿色植物用于化学物质的商业化生产的可能性正成为越来越吸引人的替代方案。与有机合成相反，绿色植物构成了可再生的能源。因为它们的独特的光合能力，在绿色植物中生产碳基化合物的唯一的原材料是二氧化碳，水和土壤，由阳光提供最终的能源。与现有的局限于尺寸的发酵设施相比，绿色植物构成了巨大的可利用的生物物质，它们能够轻易地实现化合物的大规模生产，即使它们需要大的体积，仍然是低成本的应用。尽管体内植物生产提供了较大潜力的生物物质，与昂贵的，需要消耗大量能源的，和对环境有害的化学合成相比，微生物生产同样是诱人的替代方案。可以对工业微生物进行遗传修饰，以便生产需要的遗传学终产物。Hefner等(Bioorg.Med.Chem.，101731-1741(2002))通过向能表达内源氢醌葡糖基转移酶(HQ GT)的蛇根木(Rauvolfia serpentina)的细胞悬浮培养物或向能表达相同的酶的重组大肠杆菌细胞中外源补充氢醌-一种有毒的和昂贵的底物来生产对苯二酚葡糖苷。不过，目前还没有被修饰成可以商业化生产有用含量的对苯二酚葡糖苷的合适的重组微生物。Ran等(J.Am.Chem.Soc.，12310927-10934(2001))披露了使用微生物催化剂将葡萄糖转化成中间产物奎尼酸而生产氢醌的方法。然后分离奎尼酸，并且将它化学转化成氢醌。Ran等(同上)假设在理论上可以通过pHBA中间产物利用近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)的pHBA 1-羟化酶活性将葡萄糖转化成氢醌。不过，Ran等没有披露分离pHBA 1-羟化酶基因，该基因的序列，也没有披露在植物和微生物中生产对苯二酚葡糖苷的方法。因此，要解决的问题是缺少在转基因植物，或在微生物中，或在体外以商业上有用的水平生产对苯二酚葡糖苷(氢醌葡糖苷)的方法和材料。专利技术概述本专利技术的实施方案包括表达功能性CPL(参见SEQ ID NO30)(靶定叶绿体，用于在绿色植物中生产，或不靶定叶绿体，用于细胞质微生物表达)和/或HCHL(参见SEQ ID NO38)(细胞质)，用于提高pHBA的产量。在绿色植物或在微生物中生产的优选实施方案中，CPL和HCHL是共同表达的，以便使pHBA的产量最大化。所生产的pHBA可以作为新的酶pHBA 1-羟化酶(参见SEQ ID NO23)(脱羧基)的底物，其中，它被转化成氢醌。对于宿主细胞来说是内源的或者是通过重组而工程化以进入宿主细胞的UDP-葡糖基转移酶(参见SEQ IDNO42)能对氢醌进行葡糖基化，以便形成氢醌葡糖苷(对苯二酚葡糖苷)。在优选实施方案中，在本专利技术中使用的UDP-葡糖基转移酶，与pHBA或其他苯酚代谢物相比优先对进行氢醌葡糖基化。申请人的在绿色植物中生产的优选方法所产生的回收的氢醌葡糖苷超过10％/干重量的植物叶片生物物质(biomass)；更优选的方法生产的回收的氢醌葡糖苷的量超过15％/干重量的植物叶片生物物质；最优选的方法生产的回收的氢醌葡糖苷的量超过20％/干重量的植物叶片生物物质。本专利技术的优选实施方案是用携带有合成操纵子的质粒转化过的微生物细胞，它能够表达CPL，pHBA 1-羟化酶，和拟南芥属氢醌葡糖基转移酶(图6)并且补充了合适的碳源。在缺少CPL的条件下可以将pHBA补充给具有重组pHBA 1-羟化酶的微生物。另外，在缺少CPL和pHBA 1-羟化酶的条件下可以将氢醌补充给具有重组氢醌葡糖基转移酶。另外，可以用具有含有上述成分的重组氢醌-生产微生物和的氢醌葡糖苷-生产微生物的混合的微生物培养物生产氢醌葡糖苷，每一种重组微生物的细胞密度为大约1×106-大约2×1010细胞/mL，并且，氢醌-生产微生物的数量超过氢醌葡糖苷-生产微生物的数量，其细胞比例超过1∶1-大约1∶20，以便产生氢醌葡糖苷。所述方法可以顺序使用所述微生物，或者在单一培养基中使用。本专利技术的优选实施方案对于pHBA来说，是来自近平滑假丝酵母的pHBA 1-羟化酶，它的Km为＜1μM，而Kcat至少为约9.5/秒，而对于氢醌来说是来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的葡糖基转移酶(UGT72B1)它的Km为＜1μM，而Kcat至少为42/sec。本专利技术包括在序列表中示出的核酸和氨基酸，表达盒，和包括所述成分的转基因绿色植物和微生物。附图，序列描述，和生物学保藏物的简要说明通过以下一起构成本申请的序列表，附图，生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在绿色植物中生产氢醌葡糖苷的方法，包括：　　　　ａ）在合适的条件下生长绿色植物细胞，所述绿色植物具有　　　　ｉ）分支酸的内源来源；　　　　ｉｉ）编码与ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２３所示氨基酸序列具有至少９０％同一性的活性对－羟基苯甲酸１－羟化酶的核酸片段；和　　　　ｉｉｉ）氢醌葡糖基转移酶的内源来源；和　　　　ｉｖ）具有以下结构的分支酸丙酮酸裂解酶表达盒：　　　　　Ｐ－Ｔ－Ｃ－Ｄ－ＣＰＬ　　　　其中　　　　Ｐ是适合驱动分支酸丙酮酸裂解酶基因表达的启动子；Ｔ是编码核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶叶绿体转运肽的核酸分子；Ｃ是编码核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶叶绿体转运肽裂解位点的核酸分子；而Ｄ是编码核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶叶绿体转运肽供体多肽的Ｎ－末端部分的四个连续氨基酸的核酸分子；ＣＰＬ是编码具有ＳＥＱ　　ＩＤ　　　ＮＯ：３０所示氨基酸序列的分支酸丙酮酸裂解酶的核酸分子；并且Ｐ，Ｔ，Ｃ，Ｄ，和ＣＰＬ是彼此可操作地连接的；和　　　　ｂ）回收在步骤ａ）中产生的氢醌葡糖苷。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：K迈耶，D弗林特，PV维塔宁，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]