一种提高植物耐盐性的水稻Ｃｙｐ２基因制造技术

本发明专利技术公开了一种提高植物耐盐性的水稻Ｃｙｐ２基因，具有序列表中ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．１所述的碱基序列。本发明专利技术利用以２－Ｄ电泳和质谱分析为基础的蛋白质组技术，快速分离与鉴定了一个水稻耐盐性相关蛋白质，然后通过功能基因组学和生化等手段证实Ｃｙｐ２基因具有提高植物耐盐性的功能。将本发明专利技术耐盐基因Ｃｙｐ２转化水稻或草莓等蔬菜、花卉等植物，可以提高植物耐盐性，一方面，可以增加水稻或露地蔬菜、花卉在盐碱地上的产量，提高我省滨海地区的盐碱地的利用；另一方面，可以克服因土壤返盐引起的连作障碍，提高蔬菜、花卉等植物的产量和品质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及功能基因组学，尤其是一种提高植物耐盐性的水稻Cyp2基因。
技术介绍
土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性的问题。全世界共有10亿公顷的盐碱地，约占世界陆地面积7.6％，我国盐碱地近1亿多公顷，农业耕地因盐渍化引起的减产、弃耕地就近5亿亩。近年来，随着我国设施农业的快速发展，特别是蔬菜和花卉大棚生产面积的扩大，这些保护地因化肥用量过大，土壤表层水分不断蒸发，使深层水分不断通过毛细管作用上移，导致深层土壤盐分聚积到表层，加剧了保护地的次生盐渍化进程。对于盐渍化土壤的利用主要采取两种措施，一是用化学或物理方法改良土壤；二是通过常规杂交或生物技术培育耐盐作物品种。但前者不仅投入成本高，且随着大量化学物质的施用加重了土壤的次生盐渍化，因此，挖掘植物耐盐基因资源，培育耐盐的作物品种就显得十分重要。盐分对植物胁迫分为渗透胁迫、离子伤害、离子不平衡或营养缺乏三类，渗透胁迫和离子伤害目前被认为是对植物危害的两个主要过程。植物的耐盐性总的来说可分为形态耐盐和生理耐盐。在盐胁迫下，由于外界渗透压较低，植物吸收水分困难，细胞会发生水分亏缺现象。植物为了避免这种伤害，会主动积累一些可溶性物质，降低细胞的渗透势，从而使水分顺利地进入植物体内，保证植物正常生理活动的进行。在盐胁迫条件下，植物耐盐性受多种生理机制调节。一方面，小分子相容性溶质如脯氨酸、可溶性糖、果糖、蔗糖、多胺等在植物体内大量积累对植物耐盐性起着渗透调节作用。另一方面，一些功能性蛋白如渗调蛋白、脯氨酸合成酶(P5CS)、通道蛋白(水通道蛋白和钾通道蛋白)、Lea蛋白(后期胚胎发生富集蛋白)和跨膜运输蛋白(质膜H+-ATPase和液泡膜H+-ATPase)等受盐诱导在植物体内高表达可以减缓植物盐害。植物体内Na+离子平衡是植物自身耐盐调节的重要机制。例如拟南芥SOS系列基因和水稻耐盐相关的数量性状基因SKC1的调控信号是植物自身调节Na+离子平衡或维持钠和钾平衡的重要途径。近年来，随着高通量蛋白质组技术如双向电泳、质谱技术、蛋白质芯片技术和酵母双杂交体系的建立，加速了植物蛋白质组学的发展。蛋白质组是指一个生物体基因组表达的全部蛋白质。要研究生物体中“全部蛋白质”是一件非常困难的事情。目前生物学家提出了功能蛋白组学的概念，从局部着手，注重研究那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质全体因此，从一个生物体的具有特定功能的器官、组织、细胞着手，在不同生理条件下研究表达蛋白质的功能。许多研究结果表明，利用基于2-D和生物质谱技术可以成功地分离与鉴定了水稻幼苗耐盐性相关的蛋白质。这些蛋白质主要参与碳水化合物、氮和能量代谢调节、活性氧种类清除、mRNA和蛋白加工和细胞骨架稳定性。但是，上述蛋白质仅仅在蛋白表达谱水平和种类上加以分离与鉴定，并未提供其具有改变植物耐盐性的功能证据。
技术实现思路
本专利技术提供一种提高植物耐盐性的水稻Cyp2基因。一种提高植物耐盐性的水稻Cyp2基因，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列。所述的提高植物耐盐性的水稻Cyp2基因编码的蛋白质，具有序列表中SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列。含有权利要求1所述的提高植物耐盐性的水稻Cyp2基因的表达载体。含有权利要求1所述的提高植物耐盐性的水稻Cyp2基因的转基因细胞系。本专利技术利用以2-D电泳和质谱分析为基础的蛋白质组技术，分离与鉴定水稻耐盐性相关蛋白质，根据Expasy、NCBI、TIGER等蛋白质和核酸数据库查询结果，获得水稻耐盐相关基因(或蛋白质)序列信息，然后通过功能基因组学和生化等手段证实基因功能。基因来源以杂交水稻耐盐组合汕优10号和盐敏感组合两优培九为材料，将种子播在含NaCl溶液浸湿滤纸培养皿中，置于培养箱中发芽，每天更换盐溶液，以保持盐浓度基本一致。待幼苗生长至10d，分别收集研究汕优10号和两优培九幼苗的叶片，用冷丙酮/三氯乙酸沉淀法快速提取叶总蛋白，经双向电泳分离，用PDQUEST软件分析胶图匹配情况，结果发现在汕优10号幼苗叶片中一个高表达蛋白点。在胶上切下该蛋白点，用胰蛋白酶(Trypsin)进行胶内消化(In-gel digest)，提取酶切产物，真空干燥，然后用三氟乙酸溶解，将溶解物用基质辅助激光解吸离子化飞行质谱(MALDI-TOF-MS)分析，获得肽质量指纹(Peptide Mass Fingerprint，PMF)图谱，查询Mascot数据库，以高分值比对到水稻细胞免疫素cyclophilin 2蛋白。然后用串联电喷雾质谱(ESI-MS/MS)分析上述溶解物中分离到3个肽段的氨基酸序列，结果3个肽段序列均包含于水稻细胞免疫素蛋白中，进一步证实该蛋白为水稻细胞免疫素蛋白。根据已有的水稻细胞免疫素cyclophilin 2的氨基酸序列，通过NCBI和TIGER数据库搜索，比对到编码水稻细胞免疫素蛋白peptidylprolylisomerase Cyp2的基因，基因号为Os02g02890(或OSJNBb0088N06.23)。该基因的ORF(开放阅读框)为519bp，mRNA长度为885bp。基因克隆与转化以汕优10号幼苗(播后10天)总mRNA为模板，利用RT-PCR方法扩增到peptidylprolyl isomerase Cyp2基因的编码序列，然后将Cyp2基因装入PMD18-T载体中，经测序正确，用EcoRI和HindIII酶切，回收基因片段，然后连入Super1300载体中，再转入GV3101农杆菌，鉴定正确后，通过农杆菌介导花浸法转化模式植物拟南芥，在含潮霉素的MS固体培养基上筛选转基因拟南芥阳性植株，繁种并鉴定至T3代，获得纯合的转基因12个株系。基因耐盐功能鉴定T3代纯合转基因株系和野生型((ecotype Columbia))拟南芥种子处理后培养7d，观察幼苗生长情况。待幼苗子叶完全展开后，将转基因株系和野生型的幼苗分别移入含NaCl和正常的MS培养基上，然后置于相同光温条件的培养箱中培养。培养12-15d后，观察转基因株系与野生型幼苗在高盐胁迫下的表型。结果发现在含170mM NaCl MS培养上，野生型幼苗基部叶片出现白化死亡，而转Cyp2基因株系仍保持绿色；而在200mM NaCl下，野生型幼苗全部白化死亡，转Cyp2基因株系仅在幼苗基部1-2老叶出现白化死亡，而在幼苗的生长点和其余叶片仍保持绿色，说明Cyp2基因在植物中超量表达可以缓解植物盐害。本专利技术有益效果将耐盐基因Cyp2转化模式植物拟南芥，可以提高拟南芥幼苗耐盐性。若将耐盐基因Cyp2转化水稻或草莓等蔬菜、花卉等植物，有可能提高植物耐盐性，一方面，可以增加水稻或露地蔬菜、花卉在盐碱地上的产量，提高我省滨海地区的盐碱地的利用；另一方面，可以克服设施条件下因土壤返盐引起的连作障碍，提高蔬菜、花卉等植物的产量和品质，增加农民收入。具体实施例方式以下内容涉及浓度、含量的如果没有特殊标明单位即为质量百分比浓度或含量基因的获得以杂交水稻耐盐组合汕优10号和盐敏感组合两优培九为材料，将种子播在含100mM NaCl溶液浸湿滤纸培养皿中，置于30℃培养箱中发芽，每天更换盐溶液，以保持盐浓度基本一致。待幼苗生长至10d，分别收集汕优10号和两优培九幼苗的叶片。用冷丙酮/三氯乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高植物耐盐性的水稻Ｃｙｐ２基因，具有序列表中ＳＥＱＩＤＮＯ．１所述的碱基序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：阮松林，马华升，王世恒，忻雅，钱丽华，童建新，赵杭萍，
申请(专利权)人：杭州市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]