方法技术

本发明专利技术涉及一种制备异源寡聚孔的新方法。本发明专利技术还涉及使用该方法制备的异源寡聚孔和使用该异源寡聚孔进行的多核苷酸表征。

Method

The present invention relates to a new method for preparing heterogenous oligomeric pores. The invention also relates to the heterogenous oligomeric pores prepared by the method and the characterization of the polynucleotide using the heterogenous oligomer.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】方法
本专利技术涉及一种制备异源寡聚孔的新方法。本专利技术还涉及使用该方法制备的异源寡聚孔和使用异源寡聚孔进行的多核苷酸表征。
技术介绍
目前很多应用中都需要快速廉价的多核苷酸(例如DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有技术缓慢且昂贵，这主要是因为它们依靠扩增技术来产生大量的多核苷酸，并且需要大量的专门的荧光化学物质用于信号检测。跨膜孔(纳米孔)具有作为聚合物和各种小分子的直接电生物传感器的巨大潜力。特别是，最近的焦点是将纳米孔作为潜在的DNA测序技术。当跨纳米孔施加电势时，当分析物(例如核苷酸)在桶状体中短暂驻留一段时间后，电流发生变化。核苷酸的纳米孔检测给出了已知标记和持续时间的电流变化。在链测序方法中，使单个多核苷酸链穿过孔，得到对核苷酸的鉴别。链测序可以包括使用多核苷酸结合蛋白来控制多核苷酸穿过孔的运动。Msp的不同形式是来自耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的孔蛋白。MspA为来自耻垢分枝杆菌的157kDa八聚体孔蛋白。野生型MspA不以允许DNA被表征或被测序的方式与DNA相互作用。MspA的结构以及其与DNA相互作用及表征DNA所需的修饰已有大量文献记载(Butler，2007，核酸的纳米孔分析，哲学博士论文，华盛顿大学；Gundlach，ProcNatlAcadSciUSA.2010年9月14；107(37)：16060-5.Epub2010年8月26；以及国际申请No.PCT/GB2012/050301(公布号为WO/2012/107778)。负电荷，例如位置90、91和93处的电荷，通常被从孔中除去以使其成为中性。
技术实现思路
专利技术人出人意料地证明了，可通过差异表达两种不同的单体在单个细胞中制备包含特定化学计量比的两种不同单体的异源寡聚孔。因此，本专利技术提供了一种制备包含特定化学计量比的两种不同单体的异源寡聚孔的方法，包括：(a)在第一可诱导载体中用第一不同单体转染或转化细胞；(b)在第二可诱导载体中用第二不同单体转染或转化细胞；和(c)诱导所述第一和第二可诱导载体，使得所述细胞以特定化学计量比产生包含所述第一和第二不同单体的异源寡聚孔。本专利技术还提供了：-一种使用本专利技术方法制备的异源寡聚孔；-一种表征目标多核苷酸的方法，包括：a)使多核苷酸与本专利技术的异源寡聚孔接触，使得所述多核苷酸移动通过所述孔；和b)当多核苷酸相对于所述孔移动时获取一个或多个测量值，其中所述测量值指示所述多核苷酸的一个或多个特征，并从而表征目标多核苷酸；-一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)本专利技术的异源寡聚孔，和(b)膜的组分；-一种用于表征样品中目标多核苷酸的设备，包括(a)本专利技术的多个异源寡聚孔，和(b)多个膜；-一种表征目标多核苷酸的方法，包括：a)使多核苷酸与本专利技术的异源寡聚孔、聚合酶和标记的核苷酸接触，使得通过聚合酶将磷酸盐标记的物质顺序添加到目标多核苷酸，其中磷酸盐物质含有对每个核苷酸特异性的标记；和b)使用孔检测磷酸盐标记的物质，从而表征多核苷酸；-一种形成用于表征目标多核苷酸的传感器的方法，包括形成本专利技术的异源寡聚孔与多核苷酸结合蛋白之间的复合物，并从而形成用于表征所述目标多核苷酸的传感器；和-用于表征目标多核苷酸的传感器，包括本专利技术的异源寡聚孔和多核苷酸结合蛋白之间的复合物。附图说明图1显示了10％TGX凝胶，带有用考马斯染色而可视化的条带。泳道(Lane)1对应于蛋白质分子量标记。凝胶侧面的数字对应于kDa。泳道2对应于纯化的MspA2。泳道3对应于在85℃下加热后的MspA2。泳道4对应于在50％DMSO中加热至100℃后的MspA2。泳道5对应于纯化的MspA-((Del-L74/G75/D118/L119)D56N/E59R/L88N/D90N/D91N/Q126R/D134R/E139K)8＝MspA6(均聚纳米孔作为参考)。泳道6对应于在50％DMSO中加热至100℃之后的MspA6(在这些条件下，寡聚孔可以分解成其组成单体的亚单元)。条带A对应于包含8个单体单元的寡聚MspA同源/异源孔。条带B对应于含有附着的BasTL-H6的MspA2的单体单元。条带C对应于不含有附着的BasTL-H6的MspA单体单元。图2显示了7.5％TrisHCl凝胶，其对具有或不具有不同长度的BasTL标签的MspA-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)(具有以下突变的SEQIDNO：2：G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)的寡聚作用进行了比较。泳道A对应于没有附着于任何单体的标签的同源寡聚体MspA-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8。泳道B对应于MspA-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K(单体和MspA-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K/BasTL)单体的2∶1混合物。泳道C对应于同源寡聚体MspA-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K/BasTL(减去20aa))8。泳道D对应于MspA-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)单体和MspA-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K/BasTL(减去20aa))单体的2∶1混合物。泳道E对应于同源寡聚体MspA-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K/BasTL(减去40aa))8。泳道F对应于MspA-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)单体和MspA-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K/BasTL(减去40aa))单体的2∶1混合物。凝胶带旁边引述的比例对应于标记的单体：未标记的单体的比例。图3显示了5％TrisHCl凝胶，其比较了将多种不同标签连接到C末端时MspA-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)单体的寡聚作用。泳道A对应于没有附加到任何单体的标签的同源寡聚体MspA-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8。泳道B对应于在85℃热处理15分钟的同源寡聚体MspA-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8。泳道C对应于尝试对同源寡聚体MspA-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含特定化学计量比的两种不同单体的异源寡聚孔的制备方法，包括：(a)在第一可诱导载体中用第一不同单体转染或转化细胞；(b)在第二可诱导载体中用第二不同单体转染或转化所述细胞；和(c)诱导所述第一和第二可诱导载体，使得所述细胞产生包含特定化学计量比的所述第一和第二不同单体的异源寡聚孔。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.19 GB 1502810.31.一种包含特定化学计量比的两种不同单体的异源寡聚孔的制备方法，包括：(a)在第一可诱导载体中用第一不同单体转染或转化细胞；(b)在第二可诱导载体中用第二不同单体转染或转化所述细胞；和(c)诱导所述第一和第二可诱导载体，使得所述细胞产生包含特定化学计量比的所述第一和第二不同单体的异源寡聚孔。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一不同单体与所述第二不同单体的所述特定化学计量比为至少5∶1。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一不同单体与所述第二不同单体的所述特定化学计量比为6∶1或7∶1。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和第二可诱导载体是可差异诱导的。5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(c)包括差异诱导所述第一和第二可诱导载体。6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(c)包括以不同的程度诱导所述第一和第二可诱导载体。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中，所述第一和第二不同单体由所述细胞以使得形成包含所述特定化学计量比的所述第一和第二不同单体的异源寡聚孔的比例进行表达。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对所述第一和第二不同单体中的至少一个进行修饰，以与其不存在修饰时的表达相比影响其表达。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和第二不同单体中的至少一个进行修饰，以影响其与自身或与其他不同单体寡聚的能力。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一可诱导载体和/或所述第二可诱导载体包括阿拉伯糖启动子、丙酸酯启动子、鼠李糖可诱导启动子、木糖启动子或乳糖启动子。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一可诱导载体包括鼠李糖可诱导启动子，所述第二可诱导载体包括乳糖启动子。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一可诱导载体由鼠李糖诱导，所述第二可诱导载体由异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二不同单体与肽或多肽标签进行基因融合，所述肽或多肽标签能降低所述第二不同单体与自身寡聚的能力或降低其与不存在标签时的表达相比其表达。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述标签在所述第二不同单体的羧基(C)末端进行基因融合，并降低其与自身寡聚的能力15.根据权利要求13所述的方法，其中所述标签在所述第二不同单体的氨基(N)末端进行基因融合，并与不存在标签时其表达相比降低其表达。16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述标签包括(a)4，6，8或10个连续的精氨酸(R)残基或天冬氨酸(D)残基，和/或(b)6或9个连续的组氨酸(H)残基。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述标签进一步包括丝氨酸-甘氨酸(SG)、天冬酰胺-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(NGDS)或甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-甘氨酸(GDSG)。18.根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括(d)使用所述标签纯化包含所述特定化学计量比的两种不同单体的异源寡聚孔。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二不同单体与BasTL序列(SEQIDNO：26)或其片段进行基因融合。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述BasTL序列或其片段在所述第二不同单体的羧基(C)末端进行基因融合，或者其中所述BasTL序列或其片段在所述第二不同单体的羧基(C)末端进行基因融合并将所述标签——如果存在的话——与所述第二不同单体分离。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一可诱导载体包含第一选择标记，所述第二可诱导载体包含第二选择标记。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一和第二选择标记彼此不同。23.根据权利要求22所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉科马·贾亚辛格，约翰·约瑟夫·基尔戈，尼尔·罗杰·伍德，
申请(专利权)人：牛津纳米孔技术公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB