一种单分子条件下研究级联反应的方法技术

本发明专利技术涉及一种单分子条件下研究级联反应的方法，包括酶与DNA进行连接、折纸合成、酶与折纸的组装、玻片上固定和利用单分子荧光显微镜确定催化位点。本发明专利技术的优点在于利用折纸可寻址的特点，将级联酶固定在局限的尺寸中，调控中间距离，进而固定在界面上，便于观测。体系中只含有一种酶时，不会观测到荧光产物的产生，从而确保每一次荧光闪烁是由级联反应产生。

A method for studying cascade reaction under single molecule conditions

The invention relates to a method for studying cascade reaction under single molecule condition, including enzyme joining with DNA, origami synthesis, enzyme and origami assembly, fixing on glass and using single molecule fluorescence microscope to determine catalytic site. The advantage of the invention is that the cascade enzyme is fixed in the limited size by using the characteristics of origami, which regulates the middle distance and is fixed on the interface to facilitate observation. When only one enzyme is contained in the system, the production of the fluorescent products will not be observed, thus ensuring that every fluorescence scintillation is produced by cascade reactions.

【技术实现步骤摘要】
一种单分子条件下研究级联反应的方法
本专利技术属于单分子化学领域。具体涉及一种单分子条件下研究级联反应的方法，利用DNA折纸技术构建级联酶反应体系，研究其催化单个荧光产物的方法。
技术介绍
在复杂的生物体内，重要的生化代谢反应总是有序的排列着。生物体内似乎存在着天然的选择方法来精确地调控酶分子的位置，使酶包裹在不同的细胞内进行不同的生理反应，减少细胞内不同的反应竞争造成的物质浪费并且保持各个代谢途径有效进行。生物体内的这种有序排列所导致的级联酶活性的显著增强引起科研人员的强烈兴趣，许多工作采用不同方法将级联反应的酶连在一起，并发现当两个酶距离相近时，级联反应速率显著升高。然而在这些工作并没有去除溶液中未连接的酶，所测到的是一个整体的数据，并不能反应出级联的酶的真实反应情况。针对以上问题，本专利技术提出一种单分子条件下研究级联反应的方法。
技术实现思路
本专利技术目的在于针对现有技术的不足，提出一种单分子条件下研究级联反应的方法，利用DNA折纸构建研究级联酶的反应体系，并通过观测其在单分子条件下催化荧光产物的生成可得到级联酶催化的真实反应速率。在本专利技术的技术方案中，将酶修饰DNA后，连本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单分子条件下研究级联反应的方法，将酶修饰DNA后，连接在DNA折纸的固定位点，随后利用DNA折纸作为固定介质从而将酶连接在玻璃表面，通过观测酶级联后生成的荧光产物，得到级联酶催化的反应速率，包括酶与DNA进行连接、折纸合成、酶与折纸的组装、玻片上固定和利用单分子荧光显微镜确定催化位点，其中，所述的酶与DNA进行连接是级联酶与巯基修饰的DNA进行连接，将二种级联酶分别与连接剂3‑(2‑吡啶二巯基)丙酸N‑羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）在PBS缓冲液中混合25℃孵育2hr，超滤洗去过量的SPDP，随后SPDP修饰的两种酶分别与过量的巯基修饰的DNA1、DNA2在缓冲液中混合均匀25℃孵育过夜后，...

【技术特征摘要】
1.一种单分子条件下研究级联反应的方法，将酶修饰DNA后，连接在DNA折纸的固定位点，随后利用DNA折纸作为固定介质从而将酶连接在玻璃表面，通过观测酶级联后生成的荧光产物，得到级联酶催化的反应速率，包括酶与DNA进行连接、折纸合成、酶与折纸的组装、玻片上固定和利用单分子荧光显微镜确定催化位点，其中，所述的酶与DNA进行连接是级联酶与巯基修饰的DNA进行连接，将二种级联酶分别与连接剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）在PBS缓冲液中混合25℃孵育2hr，超滤洗去过量的SPDP，随后SPDP修饰的两种酶分别与过量的巯基修饰的DNA1、DNA2在缓冲液中混合均匀25℃孵育过夜后，采用超滤洗去过量的DNA，得到二种级联酶-DNA复合物Ⅰ、Ⅱ；所述的折纸合成是将带有荧光链的替换链DNA3，生物素修饰的替换链DNA4～6，与DNA1～2分别部分互补的替换链DNA7～8、DNA9～10与原有订书钉链DNA以等量的比例混合均匀，并随后与长链单链DNAM13单链在1×TAE-Mg2+溶液体系中通过PCR退火，形成DNA折纸结构，形成的折纸结构采用超滤洗去过量订书钉链；所述的酶与折纸的组装是将级联酶-DNA复合物稀释，与DNA折纸混合均匀，级联酶-DNA复合物与DNA折纸的孵育比例5:1-20:1，于PCR仪中缓慢退火形成，形成级联酶-折纸组装体；所述的玻片上固定是将级联酶-折纸组装体，与链霉亲和素修饰的玻片孵育一定时间，孵育浓度为10-10~10-12，然后缓冲液冲洗干净过量复合物；所述的利用单分子荧光显微镜确定催化位点是在上述玻片上滴加100μL反应溶液，首先激光激发折纸上所带荧光，随后更换激光通路，激发催化产物荧光，通过二者共定位确定酶催化的位点及信号采集的位点。2.根据权利要求1所述的单分子条件下研究级联反应的方法，其特征在于，所述的酶与DNA进行连接中，PBS缓冲液为pH=7.4、100mMKCl、10mM磷酸盐缓冲液；1×TAE-Mg2+溶液体系为pH=8.0、40mMTris-乙酸、1mMEDTA、12.5mMMgCl21×TAE-Mg2+溶液。3.根据权利要求1所述的单分子条件下研究级联反应的方法，其特征在于，所述的单分子荧光显微镜为全内反射荧光显微镜，成像参数488、561nm激光控制在5%左右，曝光时间控制在30-50ms，成像温度控制在20℃左右，成像的湿度控制在50%以下。4.根据权利要求1所述的单分子条件下研究级联反应的方法，其特征在于，最后的酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：何丹农，徐艳，苏莹莹，高延静，彭天欢，孙乐乐，李迪，王萍，金彩虹，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31