上转换超分辨成像纳米探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种上转换超分辨成像纳米探针及其制备方法和应用，上转换超分辨成像纳米探针具有核@壳结构，制备方法是先采用溶剂热法，制备得到粒径可控、分散性好的稀土上转换纳米颗粒，再经过聚丙烯酸表面修饰，最后进行蛋白质修饰。将上述的上转换超分辨成像纳米探针应用于细胞的亚细胞结构的免疫荧光标记，从而实现亚细胞结构的荧光超分辨成像。相比传统的基于荧光素的超分辨光学成像方法，本发明专利技术是一种基于上转换超分辨成像纳米探针的荧光零漂白、零闪烁超分辨显微成像方法，能够对生物样品长时间观察。

Up conversion super-resolution imaging nanoprobe and its preparation and Application

The invention discloses a super resolution imaging upconversion nano probe and preparation method and application thereof, on the conversion of super resolution imaging nanoprobe with core-shell structure, preparation method is first prepared by solvothermal method, has controllable particle size and good dispersion of rare earth upconversion nanoparticles, then after polypropylene finally, acid modification, protein modification. The above up conversion super-resolution imaging nanoprobe is applied to immunofluorescence labeling of cell subcellular structure, so as to achieve sub cellular structure fluorescence super-resolution imaging. Compared with the traditional superfluorescent optical imaging method based on fluorescein, the invention is a fluorescence zero bleach and zero scintillation super resolution microscopic imaging method based on Upconversion super resolution imaging nano probe, which can observe biological samples for a long time.

【技术实现步骤摘要】
上转换超分辨成像纳米探针及其制备方法和应用
本专利技术属于荧光显微成像和免疫荧光
，特别涉及一种上转换超分辨成像纳米探针，以及该探针的制备方法和应用。
技术介绍
根据德国科学家阿贝(Abbe)根据衍射理论首次推导出衍射分辨极限，即能够被光学分辨的两点间的距离约为入射光波长的一半。因此，光学荧光成像技术的分辨率一直限制在200nm左右。这显然不能满足科学家们对亚显微结构的观察与研究。因此，近几年来多种打破光学衍射极限的荧光成像技术被提出和使用，这些突破光学衍射极限的荧光成像技术被称作超分辨荧光成像技术。受激发射损耗荧光显微技术(StimulatedEmissionDepletionMicroscopy，简称STED)就是其中一种超分辨荧光成像技术。STED荧光成像技术中主要涉及两束光：一束激发光，作用是利用受激辐射使得荧光基团产生荧光；另一束光是损耗光，即是通过相位调制所产生的空心光。作用是将激发光产生的荧光外围光斑淬灭回基态，使得外围荧光被损耗，从而提高荧光成像分辨率。STED的分辨率已经从最初的突破光学衍射极限的100nm，到如今已经能达到数纳米(5nm左右)的水平。STED因此成为许多生物学研究中重要的技术手段之一。虽然STED具有许多其他几种超分辨荧光成像技术没有的优势，如：采用激光扫描成像方式、无需复杂的成像重构过程、成像速度快且可进行三维断层扫描等。但是，STED技术仍然面临许多问题和挑战，如：成像深度低，传统的荧光探针易发生光漂白，从而导致无法对生物样品进行长时间观察等。免疫荧光成像技术(又称荧光抗体技术)，根据抗原抗体反应的原理，将荧光素/荧光基团偶联到已知的靶向特异抗原的抗体上制备成荧光探针。与细胞或组织中的特异抗原特异性的结合，细胞中主要是一些亚细胞结构，包括细胞器(细胞核、线粒体、内质网和溶酶体等)和一些非细胞器(微管、微丝和细胞膜等)的亚细胞结构，从而对待测样品(细胞或组织)中的特异抗原进行定性、定量和/或定位的检测、分析。免疫荧光技术包括荧光抗体法、荧光抗原法和免疫荧光细胞/组织化学技术等等。虽然免疫荧光技术具有特异性强、敏感度高、速度快等优势，但是目前的免疫荧光技术也存在着不足。目前免疫荧光技术实验中常用的荧光基团大多都是有机荧光染料，有机荧光染料不仅光化学稳定性差，且易发生光解与光漂白，这非常不利于生物样品(细胞或组织切片)的长时间观察。上转换纳米颗粒(Upconversionnanoparticles，简称UCNPs)作为一种新型纳米晶，近年来颇受生物医学领域的关注。主要是因为，上转换纳米颗粒是具有多种光学优势的荧光纳米材料，它能够在两个或多个低能量的光子的低功率密度下发射一个高能量的光子，从而实现能量上转换的目的。此外，上转换纳米材料还具有新颖且令人满意的光学特性，例如光化学稳定性好、无光漂白、无光闪烁、发射光谱峰狭窄对称和反斯托克斯位移大等。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种上转换超分辨成像纳米探针及其制备方法，该探针基于稀土上转换纳米颗粒的特异靶向细胞亚细胞结构，具有荧光零漂白、零闪烁的优点，这里所述的亚细胞结构包括细胞器和一些非细胞器。细胞器主要包括：细胞核、线粒体、内质网和溶酶体等，但不限于此；非细胞器主要包括：微管、微丝、中间丝和细胞膜等，但不限于此。本专利技术的另一目的在于运用常用的免疫荧光标记方法，将上述的上转换超分辨成像纳米探针应用于细胞的亚细胞结构的免疫荧光标记，并进行亚细胞结构的荧光超分辨成像。本专利技术的目的通过以下的技术方案实现：一种上转换超分辨成像纳米探针，该探针是具有核@壳结构的上转换纳米颗粒，纳米颗粒的化学组成为：以NaYF4或NaGdF4为基质，再按照一定比例掺杂至少两种(即两种或多种)的镧系稀土元素。合成的上转换纳米颗粒粒径大小为3～20nm。所述探针具有光控损耗发光的特性：根据掺杂元素不同，每一种探针存在一激发光A波长，在该A波长光激发下能得到强度高于一定阈值的荧光，存在一损耗光B波长，在该B波长损耗光作用下能进行荧光损耗。即在采用该上转换超分辨成像纳米探针时，在激发光A波长光激发下可以得到高强度荧光，同时使用另一束B波长的损耗光可以进行荧光损耗，从而具有可进行亚细胞结构的荧光超分辨成像的用途。一种上述上转换超分辨成像纳米探针的制备方法，包括步骤：首先，使用现有的溶剂热法制备出粒径可控、大小均匀且分散性良好的油溶性上转换纳米颗粒；其次，对油溶性上转换纳米颗粒进行亲水性羧基修饰，使其表面性质由疏水变为亲水性，并带有丰富的羧基，然后对上转换纳米颗粒进行蛋白修饰，进一步标记具有生物活性的抗体蛋白，进而制备出上转换超分辨成像纳米探针。优选的，使用现有的溶剂热法制备出油溶性上转换纳米颗粒的步骤如下：(1)合成油溶性上转换纳米颗粒的核结构：在油酸/1-十八烯体系中，先加入一定比例的Y(CH3CO2)3或Gd(CH3CO2)3溶液，再按照一定掺杂比例加入另外两种或多种Ln(CH3CO2)3溶液(其中Ln为镧系稀土元素)，敞口加热到140℃～160℃，搅拌反应；降至室温后，逐滴加入适量的NH4-甲醇溶液和NaOH-甲醇溶液，水浴保持在40℃搅拌2h～4h；随后撤去水浴，体系加热升温至100℃～110℃抽真空30min～40min彻底除去甲醇；结束抽真空，氩气氛围下反应升温至220℃～300℃，恒温反应30min～60min；降至室温，加入过量无水乙醇后进行离心操作，弃去上清液收集产物；用乙醇和环己烷混合液清洗，获得上转换纳米颗粒的核，产物分散在环己烷中，用于下一步的反应；(2)合成核@壳结构：上转换纳米颗粒核和惰性壳的物质的量比为1:1，向三口圆底烧瓶中加入等物质的量的Y(CH3CO2)3或Gd(CH3CO2)3溶液，8ml油酸和15ml1-十八烯，混合体系敞口加热至140℃～160℃并在该温度下搅拌反应30min～50min；反应降至80℃，加入适量步骤(1)合成的上转换纳米颗粒的核，保持30min～50min除去环己烷；随后在40℃水浴的情况下，逐滴加入适量的NH4-甲醇溶液NaOH-甲醇溶液，保持该温度并搅拌2h～4h；升温至100℃～110℃抽真空30min～40min彻底除去甲醇；最后体系在氩气氛围保护下升温至220℃～300℃，反应30min～60min；反应结束后降至室温，加入过量无水乙醇，进行离心操作，弃去上清液收集产物；用乙醇和环己烷混合液清洗，加入环己烷溶解，获得制备的核@壳结构上转换纳米颗粒。优选的，对油溶性上转换纳米颗粒进行亲水性羧基修饰的步骤是：取30ml～50mlDEG和0.5g～1gPAA(Mw＝1800)加入三口圆底烧瓶，混合搅拌加热至110℃～120℃，在氩气氛围保护下反应1h～2h；缓慢加入适量上述合成的核壳上转换纳米颗粒溶液，抽真空20min～40min；反应升温至230℃～250℃，氩气氛围保护下反应1h～2h；降至室温，往体系中加入过量的1％稀盐酸搅拌5min～20min，进行离心操作，弃去上清液收集产物；随后用50％的乙醇和去离子水清洗；最后，用去离子水溶解产物，制得羧基修饰的上转换纳米颗粒，记作UCNPs-COOH。优选的，采用EDC/NHS介导的氨基、羧基反应的共本文档来自技高网...

【技术保护点】
上转换超分辨成像纳米探针，其特征在于：该探针是具有核@壳结构的上转换纳米颗粒，该探针的化学组成是：以NaYF4或NaGdF4为基质、按照一定比例掺杂至少两种的镧系稀土元素；合成的上转换纳米颗粒粒径大小为3～20nm；所述探针具有光控损耗发光的特性：根据掺杂元素不同，每一种探针存在一激发光A波长，在该A波长光激发下能得到强度高于一定阈值的荧光，存在一损耗光B波长，在该B波长损耗光作用下能进行荧光损耗。

【技术特征摘要】
1.上转换超分辨成像纳米探针，其特征在于：该探针是具有核@壳结构的上转换纳米颗粒，该探针的化学组成是：以NaYF4或NaGdF4为基质、按照一定比例掺杂至少两种的镧系稀土元素；合成的上转换纳米颗粒粒径大小为3～20nm；所述探针具有光控损耗发光的特性：根据掺杂元素不同，每一种探针存在一激发光A波长，在该A波长光激发下能得到强度高于一定阈值的荧光，存在一损耗光B波长，在该B波长损耗光作用下能进行荧光损耗。2.将权利要求1所述的上转换超分辨成像纳米探针应用于细胞的亚细胞结构的免疫荧光标记，并进行亚细胞结构的荧光超分辨成像。3.一种权利要求1所述上转换超分辨成像纳米探针的制备方法，包括步骤：首先，使用现有的溶剂热法制备出粒径可控、大小均匀且分散性良好的油溶性上转换纳米颗粒；其次，对油溶性上转换纳米颗粒进行亲水性羧基修饰，使其表面性质由疏水变为亲水性，并带有丰富的羧基，然后对上转换纳米颗粒进行蛋白修饰，进一步标记具有生物活性的抗体蛋白，进而制备出上转换超分辨成像纳米探针。4.根据权利要求3所述的上转换纳米颗粒的制备方法，其特征在于，使用现有的溶剂热法制备出油溶性上转换纳米颗粒的步骤如下：(1)合成油溶性上转换纳米颗粒的核结构：在油酸/1-十八烯体系中，加入一定比例的Y(CH3CO2)3或Gd(CH3CO2)3溶液，再按照一定掺杂比例加入另外至少两种Ln(CH3CO2)3溶液，其中Ln为镧系稀土元素，敞口加热到一定温度以去除反应体系中的水分；降至室温后，逐滴加入适量的NH4-甲醇溶液和NaOH-甲醇溶液，水浴搅拌一段时间；随后撤去水浴，体系加热升温、抽真空并彻底除去甲醇；结束抽真空，氩气氛围下在220℃～300℃反应一段时间；随后降至室温，加入无水乙醇后进行离心操作弃去上清液收集产物；用乙醇和环己烷混合液清洗，获得上转换纳米颗粒的核，产物分散在环己烷中，用于下一步的反应；(2)合成核@壳结构：上转换纳米颗粒核和惰性壳的物质的量比为1:1，向三口圆底烧瓶中加入一定量Y(CH3CO2)3或Gd(CH3CO2)3溶液，在油酸/十八烯的混合体系中敞口加热到一定温度并不断搅拌，以去除水分；反应降至80℃，加入等比例步骤(1)合成的上转换纳米...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹求强，周超，黄冰如，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东,44