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一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体及其应用制造技术

技术编号:1712138 阅读:270 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术属生物技术领域,具体涉及一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体。该肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体是由αVβ3、αVβ5整合素的配体、连接肽、肿瘤坏死因子相关凋亡配体组成融合蛋白质,通过基因工程方法通过克隆构建该变体的编码基因、可溶性地重组表达和简便地分离纯化而生产。该肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体具有良好的肿瘤组织靶向性,具有显著增强的抗肿瘤效果,能够降低获得治疗效果所需要的蛋白质给药剂量,提高其生物利用度,降低治疗成本,能够降低和克服肿瘤坏死因子相关凋亡配体潜在的毒副作用。本发明专利技术还提供了生产可溶性、高聚体形式含量的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的表达方法和简便的分离纯化工艺。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物

技术介绍
肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族中的一个成员。与肿瘤坏死因子超家族其它成员类似,可溶性形式的肿瘤坏死因子相关配体以三 聚体形式与靶细胞表面三聚体化的受体分子结合而发挥起生物学功能。肿瘤坏死因子相关凋亡配体诱导凋亡的作用是通过与肿瘤细胞上的死亡受体4 (DR4)和 死亡受体5 (DR5)的相互作用传递死亡信号而实现的。虽然肿瘤坏死因子超家 族的其它成员由于具有全身性的毒副作用而使应用受到限制,但是肿瘤坏死因子 相关凋亡配体是一个相对的安全、具有肿瘤选择性的抗肿瘤物质。肿瘤坏死因子 相关凋亡配体在体外能诱导多种肿瘤细胞和癌化细胞的凋亡,并且在小鼠的移植 异种肿瘤,包括结肠癌、乳腺癌、多重性骨髓瘤、神经胶质瘤、前列腺癌等多种 模型中具有较好的抗肿瘤活性。尤其重要的是,在小鼠和非人类灵长类动物中全 身给药时,TRAIL表现出较小或没有毒性。基于以上原因,重组肿瘤坏死因子相 关凋亡配体己经在进行肿瘤治疗的临床研究。但是近来一些报道显示除了诱导肿瘤细胞的凋亡外,肿瘤坏死因子相关 凋亡配体还涉及到天然免疫和获得性免疫,和自身免疫性疾病相关。例如,近来 的研究报道表明它在胸腺的发育过程中调节负向选择或凋亡胸腺细胞,并且在诱 发自体免疫性疾病如I型糖尿病中起重要作用。此外,肿瘤坏死因子相关凋亡配 体的受体在整个身体广泛性表达,肿瘤坏死因子相关凋亡配体还参与肝细胞死亡 和肝炎。因此在临床上重复、全身性使用大剂量外源性肿瘤坏死因子相关凋亡配 体蛋白可能会导致不可预料的免疫结果。这些报道使科学家非常担心肿瘤坏死因 子相关凋亡配体在临床中重复和持久使用时产生潜在的副作用。如何在肿瘤治疗 时,避免肿瘤坏死因子相关凋亡配体对其它组织的毒副作用,这是肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)在潜在的临床应用中面临的难题。
技术实现思路
为克服野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤治疗方面所面临的缺陷,本 专利技术目的在于专利技术一种肿瘤组织靶向性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体,将 其靶向输送到肿瘤组织中,以此提高肿瘤坏死因子相关凋亡配体的疗效,降低其 毒副作用。为达到上述目的,本专利技术的技术方案是通过基因工程方法构建由cxVp3 、 otVp5整合素的配体、连接肽、肿瘤坏死因子相关凋亡配体组成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体融合蛋白质,即利用常规基因工程方法通过人工合成或者克隆 构建肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的编码基因、可溶性地重组表达和简便地分离纯化。其中连接肽为2-20个氨基酸残基。进一步地,aVp3 、 aVp5整合素的配体可以是一种含有RGD序列的多肽。进一步地,aV(33 、 aVp5整合素的配体可以是一种带有环柄状结构的、含 有RGD序列的多肽,例如短肽ACDCRGDCFC 。进一步地,由aV(33 、 aVp5整合素配体和肿瘤坏死因子相关凋亡配体组成 肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体在制备肿瘤治疗药物中的应用。进一步地,肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体制备的肿瘤治疗药物与现有化 疗、放疗、中药治疗、生物治疗等方法在肿瘤治疗中的联合运用。进一步地,一种在大肠杆菌中可溶性表达和简便分离纯化高含量肿瘤坏死因 子相关凋亡配体及其变体的聚体的方法。尽管目前肿瘤坏死因子相关凋亡配体在 大肠杆菌中表达多为无生物活性的包涵体产物,而本专利技术中的肿瘤坏死因子相关 凋亡配体变体的分子结构和分子量比野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体更为复 杂,因此在大肠杆菌中表达时,其包涵体形成将更为严重、纯化将更为复杂。本 专利技术采用了低温下培养和诱导表达肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的表达方法, 使得表达产物有效避免了包涵体的形成;本专利技术同时利用了肿瘤坏死因子相关凋 亡配体具有鏊合金属离子的生物功能,利用金属亲和层析和离子交换层析相结合 使得肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其变体得到了有效的纯化、获得了高纯度的蛋 白质产物,而且纯化产物具有高比例的聚体形式,因此具有非常好的生物活性。其中低温指35。C-10。C。整合素aV(33、 aVp5在休眠期细胞和正常的血管细胞中表达量极低,然而 在多种肿瘤细胞(例如黑色素瘤,结肠癌,乳腺癌,子宫癌)和肿瘤血管内皮 细胞表达量显著上调。上述由aVp3 、 aV(35整合素配体、肿瘤坏死因子相关凋 亡配体组成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体可以大大提高肿瘤坏死因子相关 凋亡配体在肿瘤组织中的分布、实现肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤组织中的 靶向输送、大大提高肿瘤坏死因子相关凋亡配体的抗肿瘤效果、同时显著降低肿 瘤坏死因子相关凋亡配体的用量。同已有的肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其变体相比,本专利技术具有鲜明的特色 和创新之处(1) 更好的肿瘤组织靶向性现有的肿瘤坏死因子相关凋亡配体对于肿瘤组织的相对选择性作用主要是利用肿瘤组织表达的死亡受体4和死亡受体5来显 示实现的,而本专利专利技术的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体除了利用肿瘤组织表 达的死亡受体4和死亡受体5之外,还利用肿瘤组织丰富表达aVp3 、 aV(35整 合素的特点,从而更为有效地实现了肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤组织的耙 向输送。(2) 更为高效的抗肿瘤效果由于实现了肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿 瘤组织中的靶向投递,本本专利专利技术的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体与相同剂 量的肿瘤坏死因子相关凋亡配体相比,无论在单独使用、还是与现有的化疗、放 疗、中药治疗、生物治疗等方法联合使用时都表现出具有更好的抗肿瘤效果。(3) 更低的使用剂量由于肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体比相同剂量的 肿瘤坏死因子相关凋亡配体具有更好的抗肿瘤效果,因此在使用时,能够在保证 相同抗肿瘤疗效的情况下,大大降低肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体蛋白质的用 量。肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体蛋白质给药剂量的降低将能够克服肿瘤坏死 因子相关凋亡配体在肿瘤治疗中潜在的副作用,同时可以降低肿瘤患者的治疗费 用,达到高效、低毒副作用、低成本肿瘤治疗的效果。(4) 便于表达和生产与通过肿瘤细胞特异性抗体及其抗体片段耙向的肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白质不同,本专利专利技术将肿瘤坏死因子相关凋亡配体与aVI33和aVp5整合素的短肽配体相融合,分子量增加不大,从而更有利于肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的基因克隆、表达和生产,产量更高。(5)可溶性的表达和简易的分离纯化尽管目前肿瘤坏死因子相关凋亡配 体在大肠杆菌中表达时易形成无生物活性的包涵体产物,而本专利专利技术的肿瘤坏 死因子相关凋亡配体变体的分子结构和分子量比野生型肿瘤坏死因子相关凋亡 配体更为复杂,因此在大肠杆菌中表达时,其包涵体形成将更为严重、纯化将更 为复杂。本专利技术采用了低温下培养和诱导表达肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的 表达方法,使得表达产物有效避免了包涵体的形成;本专利技术同时利用了肿瘤坏死 因子相关凋亡配体具有鏊合金属离子的生物功能,将金属亲和层析和离子交换层 析方法相结合使得肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其变体得到了有效的纯化、获得 了高纯度的蛋白质产物。本专利技术专利通过可溶性表达和简易分离纯化方法的优化 最终导致纯化产物具有高比例的聚体形式,从而保证了获得的产物具有非常好的 生物活性。生产高比例聚体形式的肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其变体,本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体,其特征是由αVβ3和αVβ5整合素的配体肽段、连接肽、肿瘤坏死因子相关凋亡配体构建而成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体融合蛋白质,其中连接肽为2-20个氨基酸残基。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:华子春曹林
申请(专利权)人:南京大学
类型:发明
国别省市:84[中国|南京]

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