6’‑SL、LNnT和LST c 的三元混合物制造技术

一种基本上由6’‑SL、LNnT和LSTc组成的人乳低聚糖的混合物，其通过在α2,6‑转唾液酸酶的存在下对6’‑SL和LNnT进行处理而制得。

Three yuan SL, \mixture of 6 LNnT and LST C

A mixture of basically consists of 6 \SL, LNnT and LSTc in human milk oligosaccharides, through to 6\ SL and LNnT were prepared to sialidase in the presence of a 2,6.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】6’-SL、LNnT和LSTc的三元混合物
本专利技术涉及人乳低聚糖(HMO)的三元混合物，特别是6’-O-唾液酸基乳糖(6’-SL)、乳-N-新四糖(LNnT)和唾液酸基乳-N-四糖c(LSTc)的混合物，用于制备该三元混合物的方法，以及该三元混合物在人类健康中的应用。
技术介绍
HMO已经成为近年来极为关注的课题，因为其在人类机体中发生的许多生物学过程中发挥作用。哺乳动物乳汁包含这些复杂的低聚糖中的至少130种(Urashima等人:MilkOligosaccharides,NovaBiomedicalBooks,NewYork,2011,ISBN:978-1-61122-831-1)。此前，HMO的唯一来源是主要包含水、以及55-70g/l乳糖、24-59g/l脂质、约13g/l蛋白质、5-15g/lHMO和约1.5g/l矿物质的哺乳动物乳汁。然而，在过去十年中，开发用于合成这些低聚糖的方法的努力显著增加，因为其在许多人生物学过程中发挥作用。在这方面，已经开发出通过微生物发酵、酶法、化学合成或这些技术的组合来制备HMO的方法。例如，通过化学方法，可如WO2011/100980和WO2013/044928中所述制备LNnT，可如WO2012/155916和WO2013/044928中所述合成LNT，可如WO2013/091660中所述制备LNT和LNnT的混合物，可如WO2010/115934和WO2010/115935中所述制备2’-FL，可如WO2013/139344中所述制备3-FL，且可如WO2010/100979中所述制备6’-SL及其盐。作为生物技术方法的实例，WO01/04341和WO2007/101862描述了如何使用基因改造的大肠杆菌(E.coli)制备任选由岩藻糖或唾液酸取代的核心人乳低聚糖。作为酶法的一个实例，可如EP-A-577580中所述制备唾液酸化低聚糖。还已经致力于开发用于酶法合成HMO低聚糖的混合物，而不必如WO2012/156897和WO2012/156898中所述合成混合物的所有低聚糖组分的方法。这些方法已经提供了包含多种不同低聚糖的反应混合物。然而，仍在寻求更好的用于合成HMO的混合物的方法。有证据表明，人消化道中称为微生物组(microbiome)的微生物的定居群落在健康和疾病中起着重要作用。当微生物组的正常组成失去平衡时，人宿主可能会遭受后果。最近的研究涉及到例如癌症、肥胖、炎性肠病、银屑病、哮喘、以及甚至可能是自闭症的多种疾病中的微生物组的失衡。据信HMO积极地调节微生物组，并且将它们用于此目的越来越感兴趣。然而，HMO的显著多样性，加上缺乏可得性，已经阻碍对各个HMO的特定功能的研究。明确需要特定的HMO或HMO的组合从而以期望的方式调节微生物组，以便解决特定的人健康问题。
技术实现思路
本专利技术的第一方面涉及一种基本上由6’-O-唾液酸基乳糖(6’-SL)、乳-N-新四糖(LNnT)和唾液酸基乳-N-四糖c(LSTc)组成的HMO的第一混合物。有利的是，在该第一HMO混合物中，LSTc相对于(6’-SL+LNnT)的摩尔比为至少1：18，有利地为至少1：8，更有利地为至少1：5，甚至更有利地为至少1：3。同样有利的是，在第一混合物中，6’-SL相对于LNnT的摩尔比为0.18-5.5，更有利地为0.3-3，还更有利地为约1。本专利技术的第二方面涉及一种通过在α2,6-转唾液酸酶的存在下，使6’-SL供体和LNnT受体进行反应，然后从反应介质中除去乳糖和α2,6-转唾液酸酶来制备第一HMO混合物的方法。有利的是，该方法包括使用摩尔比为1：3至3：1、有利地为1：2至2：1、更有利地为1：1的6’-SL和LNnT，α2,6-转唾液酸酶对于6’-SL和LNnT的反应的转化率为至少20％至多55％，有利地为至少30％，更有利地为至少40％，甚至更有利地为至少45％。本专利技术的第三方面涉及一种基本上由6’-SL、LNnT、LSTc和乳糖组成的HMO的第二混合物。有利的是，在该第二混合物中：-(6’-SL+LNnT)相对于LSTc的摩尔比为2-18，并且-乳糖相对于LSTc的摩尔比为约1。更有利的是，6’-SL与LSTc的摩尔比以及LNnT与LSTc的摩尔比中之一不超过4。甚至更有利地，第二HMO混合物的6’-SL与LNnT的摩尔比为0.18-5.5。本专利技术的第四方面涉及一种通过在α2,6-转唾液酸酶的存在下，使6’-SL供体和LNnT受体进行反应，然后从反应介质中除去α2,6-转唾液酸酶来制备第二HMO混合物的方法。所得反应混合物是本专利技术的第二HMO混合物。本专利技术的第五方面涉及一种用于治疗病毒和/或细菌感染的抗感染组合物，其包含6’-SL、LNnT和LSTc。该组合物包含具有新性质和生物学活性的多种不同HMO的混合物。具体而言，该组合物增加人的微生物组的双歧杆菌(Bifidobacterium)丰度。此外，该组合物抑制病原体结合，从而保护宿主免受感染，特别是呼吸道感染。该组合物也可用于治疗和/或降低人的广泛范围的病毒和/或细菌感染、特别是呼吸道感染的风险。该抗感染组合物有利地是本专利技术的第一或第二混合物，更有利地是第一混合物，如上所述。本专利技术的第六方面涉及一种调节人、特别是非婴儿个体的微生物组以增加双歧杆菌丰度的方法。该方法包括向所述人施用6’-SL、LNnT和LSTc，有利地施用本专利技术的第一或第二混合物，更有利地施用第一混合物，如上所述。本专利技术的第七方面涉及一种预防或治疗人、特别是非婴儿个体的病毒和/或细菌感染、特别是呼吸道感染的方法。该方法包括向人施用6’-SL、LNnT和LSTc的混合物，有利地施用本专利技术的第一或第二混合物，更有利地施用第一混合物，如上所述。附图说明以下附图意在进一步示例说明本专利技术。它们不意在限制本专利技术的主题。图1：示出3个α2,6-转唾液酸酶的序列和比对，该3个α2,6-唾液酸基转移酶为：由其信号肽(Δ2-15)截短的鳆发光杆菌(P.leiognathi)JT-SHIZ-119唾液酸基转移酶(SEQIDNo.1)，由其信号肽(Δ2-15)截短的鳆发光杆菌JT-SHIZ-145唾液酸基转移酶(SEQIDNo.2)，和由其信号肽(Δ2-15)截短的美人鱼发光杆菌(P.damselae)JT0160唾液酸基转移酶(SEQIDNo.3)。通过使用CLUSTALOmega(1.2.1)(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行多重序列比对(MSA)来比对序列。图2：示出2个α2,6-唾液酸基转移酶的序列和比对，该2个α2,6-唾液酸基转移酶为：由其信号肽(Δ2-15)截短的鳆发光杆菌JT-SHIZ-119唾液酸基转移酶(为SEQIDNo.1)，和由其信号肽(Δ2-15)截短的鳆发光杆菌JT-SHIZ-145唾液酸基转移酶(SEQIDNo.2)。通过使用EMBOSSNeedle(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)进行成对序列比对来比对序列。图3：示出2个α2,6-唾液酸基转移酶的序列和比对，该2个α2,6-唾液酸基转移酶为：由其信号肽(Δ2-15)截本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人乳低聚糖(HMO)的混合物，其基本上由6’‑O‑唾液酸基乳糖(6’‑SL)、乳‑N‑新四糖(LNnT)和唾液酸基乳‑N‑四糖c(LST c)组成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.09 EP 15171177.71.一种人乳低聚糖(HMO)的混合物，其基本上由6’-O-唾液酸基乳糖(6’-SL)、乳-N-新四糖(LNnT)和唾液酸基乳-N-四糖c(LSTc)组成。2.根据权利要求1所述的混合物，其中LSTc相对于(6’-SL+LNnT)的摩尔比为至少1：18，优选为至少1：8，更优选为至少1：5，甚至更优选为至少1：3。3.根据权利要求1或2所述的混合物，其中6’-SL相对于LNnT的摩尔比为0.18-5.5，优选为0.3-3，更优选为约1。4.一种HMO的混合物，其基本上由6’-SL、LNnT、LSTc和乳糖组成。5.根据权利要求4所述的混合物，其中：-(6’-SL+LNnT)相对于LSTc的摩尔比为2-18，并且-乳糖相对于LSTc的摩尔比为约1。6.根据权利要求4或5所述的混合物，其中6’-SL与LSTc的摩尔比以及LNnT与LSTc的摩尔比中之一不大于4。7.根据权利要求4至6所述的混合物，其中6’-SL与LNnT的摩尔比为0.18-5.5。8.一种用于获得根据权利要求1-3中任一项所述的混合物的方法，其包括以下步骤：使6’-SL和LNnT在α2,6-转唾液酸酶的存在下进行反应以产生反应介质，然后从所述反应介质中除去乳糖和所述α2,6-转唾液酸酶。9.一种用于获得根据权利要求4-7所述的混合物的方法，其包括以下步骤：使6’-SL和LNnT在α2,6-转唾液酸酶的存在下进行反应以产生反应介质，然后从所述反应介质中除去所述α2,6-转唾液酸酶。10.根据权利要求9所述的方法，其包括以下步骤：使6’-SL和LNnT在α2,6-转唾液酸酶的存在下以1：3至3：1、优选1：2至2：1、更优选1：1的摩尔比进行反应，所述α2,6-转唾液酸酶对于6’-SL和LNnT的反应的转化率为至少20％、至多约55％，优选为至少30％，更优选为至少40％。11.根据权利要求10所述的方法，其包括以下步骤：使6’-SL和LNnT在α2,6-转唾液酸酶的存在下以1：1的摩尔比进行反应，所述α2,6-转唾液酸酶对于6’-SL和LNnT的反应的转化率为至少20％、至多约45％，优选为至少30％，更优选为至少40％。12.根据权利要求10所述的方法，其包括以下步骤：使6’-SL和LNnT在α2,6-转唾液酸酶的存在下以1：1的摩尔比进行反应，所述α2,6-转唾液酸酶对于6’-SL和LNnT的反应的转化率为30-45％。13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其中所述α2,6-转唾液酸酶具有与SEQIDNo.1的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，并且其包含以下至少一种：-在156位的氨基酸选自Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln或Trp，优选Ser、Cys或Tyr；和/或-在161位的氨基酸选自Ala、Val、Ile、Leu、Phe、Tyr、Trp或Gly，优选Phe或Gly；和/或-在180位的氨基酸选自Asp、Asn、Gln，优选Asp；和/或-在186位的氨基酸选自Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Cys或Thr，优选Tyr、Cys或Leu；和/或-在218位的氨基酸选自Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp、Cys、Gly或Thr，优选Ile、Val、Phe或Tyr；和/或-在222位的氨基酸选自Gln、Asp、Glu、Cys、Thr、Phe、Tyr、Trp、Arg、Lys或His，优选Cys、Asp、Arg或Phe；和/或-在235位的氨基酸选自Arg、His、Ser、Cys、Ala、Val...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·钱皮恩，B·麦康奈尔，G·戴卡尼，
申请(专利权)人：格礼卡姆股份公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK