一种微生物近自然纯培养的微孔滤膜培养装置制造方法及图纸

本实用新型专利技术公布一种以近自然培养法为原理的微生物近自然纯培养的微孔滤膜培养装置，装置为有孔的培养容器，容器内衬有一层至数层微孔滤膜，灭菌后加入无菌培养基可用于微生物纯培养。培养时将该有孔容器放入被培养微生物所需的环境中，使膜内微生物可同外界微生物交流和通讯、但膜内微生物又难以逃逸或被污染，从而使被培养微生物获得一种接近自然的培养条件。该培养装置可增强许多自然环境中微生物的可培养性，甚至使部分未培养微生物的分离纯化成为可能。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
一种微生物近自然纯培养的微孔滤膜培养装置
本技术属于微生物培养
，具体涉及一种微生物近自然纯培养的微孔滤膜培养装置。
技术介绍
自然界中微生物多样性越来越受到各国科学家的关注，科学家根据现有的科学证据推测微生物种类数目应该在105-106。但令人遗憾的是，仅有5,000种以下的原核生物被文献描述过，流行的Approved List of Bacterial Names记载了3,500种，权威的Bergey氏手册中记录了3,100种。这也就是意味着所知细菌可能仅占环境细菌多样性的1％或者更少。显然，99％未曾描述过的原核微生物肯定有着更多的遗传、代谢和功能多样性，是一种看不见的国家资源。微生物的研究长期以来受到培养方法和培养装置的限制。德国医生罗伯特·科赫(Robert Koch，1843-1910)曾用煮沸消毒的土豆来培养细菌；1887年，Richard Petri发表了一篇短文，对Koch平板技术作了又一次的改进，设计了我们今天所使用的培养皿(Petri dish)。从那时到现在，纯培养技术(pure culture technique)就被频繁和常规地在微生物实验室里用于分离、纯化、活细胞计数和培养微生物，一直成为研究微生物的基石，以至于这一方法看起来也理所当然。在这一百多年来，微生物学取得了长足的进步，新的微生物不断地被分离出来，但这远是很少一部分自然资源。Amann RI等(1995)报道，使用标准微生物学培养技术对不同生境微生物可培养性(culturability)的测定来看，海水中微生物的可培养性约为0.001～0.1％，淡水约为0.25％，土壤约为0.3％，活性污泥为1～15％左右。有些微生物被许多实验室证实是活动的，但却不可培养，成为一种活动的但不可培养(viable but nonculturable，VBNC)状态，至少有16个属的30种细菌被报道有此现象发生。虽然自然培养、富集培养(enrichment culture)等为培养微生物提供了适宜的营养和生理组合，然而，最后的分离、纯化仍然离不开传统的纯培养技术。因此，微生物的纯培养技术的局限性，无疑已经成为了微生物学进一步研究发展的一个瓶颈，仍然需要进一步寻找新的培养手段和方法。近年来，随着分子生物学的飞速发展，利用分子技术研究自然生境微生物的非培养法(culture-independent method)越来越多地被广泛使用，有些甚至使用一些能够在原位进行研究的技术，这些在很大程度上跨越了遏制微生物研究必须纯培养这个瓶颈，不断地揭示出自然界新的16S rRNA序列类型，使得我们能够认识越来越多的微生物。现在，-->约有40个细菌类群成为已知，其中1/3的类群完全由未培养(nonculturable)细菌组成，它们仅以16S rRNA序列方式被记录下来。在许多环境中，这些新细菌类群和谱系占优势地位。但是，得到的这些微生物序列，对其形态、生理代谢、遗传和生态功能等方面的知识仅仅是靠推测获得；另外，那些只有在微生物被培养出来才能够产生的化学物质，如今也不可能被研究和获得。因此，虽然非培养法已经有了长足的进步，但为了完全了解微生物在自然环境中的功能角色，现有的富集和分离策略就需要提高，仍然需要发展新的培养方法。但迄今为止，增强微生物的可培养性、把更多的未培养微生物(nonculturable microorganism)转变成为可培养仍然只是微生物学家的一个梦想。为什么众多的微生物难以用纯培养法被培养在人工培养基上呢？这是因为纯培养法本身是指从自然界中只将特定微生物分离出来，在人工培养基上增殖，这意味着被培养微生物是处于一种同自然界其它微生物和大多数有关物质隔绝的单纯条件下。然而，自然细菌群落具有高度多样性，微生物原来生存的自然生境要复杂、丰富得多，因此很难用一套培养装置和方法让大多数细菌生长。另外，还有一系列的因素阻碍了微生物在人工培养基上的复原和培养：(1)许多微生物的复原需要提供天然样本中的原始生态环境，这些小生境(niche，或称为生态位)难以在人工条件下复原，极微小的变化都有可能使其丧失生活力(viability)。(2)纯培养中极度变化的营养水平甚至可能成为主要生长障碍，特别对贫营养水体中的微生物和那些生存策略(K-选择)适宜于低营养含量和很低生长率的种类，提供营养成分丰富的培养基反而成为阻碍微生物复原的重要因素，甚至底物加速死亡(substrate-accelerated death)。(3)对细菌培养的潜在重要的ATP(它在海水淡水中的浓度可达1nM，很可能源自浮游植物和其它浮游生物)和其它活性物质，纯培养阶段很难被提供，而且很难以活性状态提供。(4)微生物的自然生态环境中许多种类相互依存，同一生境的微生物之间联系千丝万缕，细胞与细胞之间有着广泛的通讯和联系，在大多数饥饿状态下微生物基因表达所涉及的cAMP、大多数革兰氏阴性菌间的N-乙酰高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactones)都有可能是细胞之间沟通的信号分子，这些正逐渐被微生物学的不断发展所揭示和证明。(5)共代谢(cometabolism)方式是很可能是微生物在自然界中生存的重要模式之一，共栖、互生、共生便是微生物自然生态关系中共同协作生存方式的不同层次。显然，传统的微生物纯培养方式完全隔绝了被培养微生物同外界的交流和通讯，使-->其难以获得特定生境和特定生物的活性物质，因此，自然界中的大部分微生物从其原生环境中被带走时就会萎缩、凋谢，难以被现有纯培养方法培养或可培养性很低(lowculturability)。长期以来，微生物学家为了进一步加强微生物可培养性、改善微生物从环境样本中复原的状况，主要从两个不同的角度来进行研究：一是试验如何尽量在自然条件下使微生物增殖，称为自然培养法；二是探索在普通的纯培养中，加入什么样的新条件便可大大地接近自然条件，既近自然培养法。土壤微生物学家维诺格拉德斯基(Winogradsky)很重视微生物的自然培养，建立Winogradsky Column用于富集硫化菌和硝化菌，并成为微生物富集培养的先锋；Rossi-Cholodny埋片法(Rossi-Cholodny buried slide technique)仍然是自然培养的最好的例子，Henrichi(1932)的报告认为，载玻片在淡水中保持一定时间后，在显微镜下可观察到多种多样的未知微生物；Aristovskaya和Parinkina(1962)等前苏联土壤微生物学者提出的毛细管测数法也是一种在自然条件下的增殖培养。对近自然纯培养的研究，则多是在增殖培养基的组成方面尽量接近在自然界活动的微生物的营养条件，如用土壤抽提液作为培养土壤微生物的基本成分，河水或海水作为必要的添加来培养各自水体中的微生物，植物汁液加入培养基用于培养植物病原菌等，但在该方面仍然没有取得革命性的进步。该思想最成功的范例应该是Kaeberlein T等(2002)在Science杂志上的报道，他们使用了微孔滤膜、中间加隔片的装置对沙滩微生物进行过培养，模拟沙滩生境，结果他们获得了成功，证明该方法能够有效地增强部分微生物的可培养性，而且已经有两个菌株被证明是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微生物近自然纯培养的微孔滤膜培养装置，其特征在于：该装置是一种下部有孔的容器结构，容器内衬有一层或者数层微孔滤膜，滤膜内加有培养基。

【技术特征摘要】
1、一种微生物近自然纯培养的微孔滤膜培养装置，其特征在于：该装置是一种下部有孔的容器结构，容器内衬有一层或者数层微孔滤膜，滤膜内加有培养基。2、根据权利要求1所述的微孔滤膜培养装置，其特征是：微孔滤膜松散地内衬有孔容器内。3、根据权利要求1或2所述的微孔滤膜培养装置，其特征是：微孔滤膜和有孔容器合...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶姜瑜，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：实用新型
国别省市：85[中国|重庆]