抑制甲型流感病毒复制的shRNA序列及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一段shRNA序列：GCTGGTCTGACTCACATAATG，将该序列退火后，插入siRNA表达质粒，转化大肠杆菌。经过克隆PCR筛选阳性克隆，保留菌种。扩增基因工程菌，提取纯化质粒。将该质粒转染MDCK细胞。然后以流感病毒感染该细胞，48小时后，收集细胞培养上清，提取总RNA，以RT‑PCT方法检测培养上清中的流感病毒含量。以该质粒与PEI复合物形式给予BALB/C小鼠雾化吸入，连续3天，每天30分钟。然后以流感病毒攻击该小鼠，3天后处死小鼠。取出肺脏制成组织匀浆，从组织匀浆中提取总RNA以RT‑PCT方法检测培养上清中的流感病毒含量。根据不同组流感病毒的含量可以确定该shRNA具有抑制流感病毒复制的作用。

ShRNA sequence and its application to inhibit the replication of influenza A virus

The invention provides a sequence of shRNA: GCTGGTCTGACTCACATAATG, which is annealed, inserted into the siRNA expression plasmid and transformed into Escherichia coli. The positive clones were screened by cloned PCR, and the bacteria were retained. The gene engineering bacteria were amplified and the plasmid was extracted and purified. The plasmid was transfected into MDCK cells. Then the cells infected with influenza virus, 48 hours later, supernatants were collected from total RNA to RT PCT method for detection of influenza virus in the supernatant. In the form of the plasmid and PEI complex, the BALB/C mice were inhaled for 3 days for 30 minutes a day. Then the mice were attacked with the flu virus, and the mice were killed 3 days later. Remove the lung made tissue homogenate, extracted by RT PCT method for detection of influenza virus in the supernatant from homogenates of total RNA. According to the content of different groups of influenza viruses, it can be determined that the shRNA can inhibit the replication of influenza virus.

【技术实现步骤摘要】
抑制甲型流感病毒复制的shRNA序列及其应用
本专利技术涉及RNA干扰导致基因沉默技术，特别提供一种抑制甲型流感病毒复制的shRNA序列及其应用，在流感大规模流行时可以干预病毒对健康人群的感染以及抑制患病人群体内流感病毒的复制。
技术介绍
甲型流感病毒是一种传染性最强的人类呼吸道疾病。在1918年流感病毒世界大流行期间，死于流感的人数超过20,000,000。该病毒的特点是：(1)通过空气飞沫传播，传播速度快。(2)由于病毒抗原不断变异，逃避免疫系统对病毒的防御作用，使新研制的流感疫苗失去作用。(3)定期产生新的病毒毒力株，在新型疫苗还未研制成功之前造成大流行。由于流感病毒寄居于细胞内，传统的抗病毒药物对于预防和治疗流感病毒感染的作用有限，而且抗病毒药物具有一定的毒副作用，以及出现耐药的病毒株，使其应用受到限制。因此，目前还没有有效的方法预防和治疗流感病毒感染，流感病毒对人类健康仍然是一种很大的和潜在的威胁。RNA干扰(RNAi)是一种由短的双链RNA(又称为小干扰RNA)介导的翻译后基因沉默的形式。在该过程中，细胞的复合Dicer酶裂解双链RNA分子，产生长度为21-25核苷酸的双链的双连单位。这些小干扰RNA再导引RNA干扰诱导的沉默复合体(RISC)裂解与小干扰RNA序列一致的靶mRNA。许多研究证实小干扰RNA在转入到哺乳动物细胞内后可以明显地抑制基因表达。这些发现提出了一种可能性，即RNA干扰可能抑制病毒基因的表达并保护细胞免于病毒感染。流感病毒是一种由8个片段组成的单链RNA病毒，其中血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)片段经常发生变异，是流感病毒变异的主要分子基础。而另外6个片段为M，NP，NS，PA，PB1，PB2.这6个片段为保守区域，其核苷酸序列相对稳定，是干扰RNA技术常用的靶序列。这6个片段在流感病毒的复制、病毒颗粒装配及感染健康细胞等过程中起重要作用。我们在对流感病毒测序的基础上，设计了针对流感病毒NP片段的小干扰RNA，以期通过RNA干扰技术抑制流感病毒在细胞水平以及动物水平的复制，达到预防和治疗流感病毒感染的目的。
技术实现思路
本专利技术根据RNA干扰的机理，在对流感病毒NP片段进行基因测序的基础上，设计了一段shRNA序列，该shRNA具有抑制流感病毒复制的作用。本专利技术技术方案如下：一种抑制甲型流感病毒复制的shRNA序列，其特征在于，shRNA序列为：GCTGGTCTGACTCACATAATG。将该序列退火后，插入siRNA表达质粒，转化大肠杆菌。经过克隆PCR筛选阳性克隆，保留菌种。扩增基因工程菌，提取纯化质粒。将该质粒转染MDCK细胞。然后以流感病毒感染该细胞，48小时后，收集细胞培养上清，提取总RNA，以RT-PCT方法检测培养上清中的流感病毒含量。以该质粒与PEI复合物形式给予BALB/C小鼠雾化吸入，连续3天，每天30分钟。然后以流感病毒攻击该小鼠，3天后处死小鼠。取出肺脏制成组织匀浆，从组织匀浆中提取总RNA以RT-PCT方法检测培养上清中的流感病毒含量。根据不同组流感病毒的含量可以确定shRNA具有抑制流感病毒复制的作用。本专利技术所述shRNA序列的引物，其特征在于，引物序列如下：上游引物序列NP-391-F：5’-CCGGGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGCTTTTTTG-3’；下游引物序列NP-391-R：5’-AATTCAAAAAAGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGC-3’。本专利技术所述shRNA序列可用于制备抑制甲型流感病毒复制的生物制剂。本专利技术还提供一种防治流感的实验方法，其特征在于：根据humanNP基因的转录本设计siRNA靶点，安排引物合成；将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切线性化的RNA干扰载体，替换掉原来的ccdB毒性基因；菌落PCR筛选转化子，筛选的阳性克隆进行测序验证；测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提；具体步骤如下：1)、干扰靶点设计和引物合成：根据shRNA设计的一般原则，设计siRNA靶点，安排引物合成；2)、引物退火形成带粘性末端的双链片段：将合成好的oligo用oligoannealingbuffer溶解成20μM，互补单链各取30μl混合；然后将oligo混合物在水浴锅中95℃加热5min，然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温，形成双链oligo片段；取1μl用于后续的连接反应，其余-20℃保存；3)、线性化表达载体的制备：用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅中孵育2h以上；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书；4)、干扰片段连接入表达载体：5)、感受态细胞的转化：DH5α感受态细胞的转化；6)、菌落PCR鉴定阳性转化子：挑取平板上长出的转化子重悬于10μlLB培养液中，取1μl做模板进行菌落PCR鉴定；7)、阳性克隆送测序：菌落鉴定得到的阳性克隆，进行测序验证；用VectorNTI软件比对测序结果，对测序结果进行分析；8)、质粒小提：经测序验证正确的阳性克隆，命名为pLKD-NP-391，安排质粒小提，具体步骤见试剂盒说明书。附图说明图1干扰载体pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA载体图谱。图2表达载体经过AgeI和EcoRI双酶切后的线性化(1.未酶切的干扰载体；2.经AgeI和EcoRI双酶切的干扰载体；3.1kbDNAladderMarker：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)。图3NP-391菌落PCR鉴定图(1.阴性对照(水)，2.阴性对照(空载体质粒)；3.DL2,000DNAMarker：2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp，4-11.挑取的8个转化子)。图4转染了干扰质粒和空质粒后的MDCK细胞表达绿色荧光蛋白(左：转染空质粒PLKD-007；右：转染干扰质粒PLKD-NP-391)图5pLKD-NP-391干扰质粒抑制流感病毒的复制(#，p<0.01，和Control组相比；*，p<0.01，和Mock组相比；Mock组代表空质粒组)图6绿色荧光蛋白在未转染质粒和转染了空质粒或干扰质粒的小鼠肺组织中的表达(**，p<0.01，和对照组相比)。图7不同组小鼠肺组织冰冻切片中绿色荧光蛋白的表达(其中A.干扰质粒组；B.空质粒组；C.对照组)。图8干扰质粒pLKD-NP-391抑制小鼠肺组织中流感病毒的复制(**，p<0.01，和对照组相比；#，p<0.05，和空质粒组相比)。具体实施方式实施例1流感病毒NP片段shRNA表达质粒的构建、转化大肠杆菌及阳性克隆的筛选。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制甲型流感病毒复制的shRNA序列，其特征在于，shRNA序列为：GCTGGTCTGACTCACATAATG。

【技术特征摘要】
1.一种抑制甲型流感病毒复制的shRNA序列，其特征在于，shRNA序列为：GCTGGTCTGACTCACATAATG。2.一种用于制备权利要求1所述shRNA序列的引物，其特征在于，引物序列如下：上游引物序列NP-391-F：5’-CCGGGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGCTTTTTTG-3’；下游引物序列NP-391-R：5’-AATTCAAAAAAGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGC-3’。3.一种采用权利要求1所述shRNA序列制备的抑制甲型流感病毒复制的生物制剂。4.一种防治流感的实验方法，其特征在于：根据humanNP基因的转录本设计siRNA靶点，安排引物合成；将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切线性化的RNA干扰载体，替换掉原来的ccdB毒性基因；菌落PCR筛选转化子，筛选的阳性克隆进行测序验证；测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提。5.按照权利要求4所述实验方法，其特征在于，具体步骤如下：1)、干扰靶点设计和引物合成：根据shRNA设计的一般原则，设计siRNA靶点，安排引物合成；2)、引物退火形成带粘性末端的双链片段：将合成...

【专利技术属性】
技术研发人员：马壮，孙文武，史亮，王忠华，曹建平，
申请(专利权)人：中国人民解放军沈阳军区总医院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21