本发明专利技术涉及到一种通用的肝癌肿瘤抗原组合物、该抗原组合物的具体组分、制备方法、以及该抗原组合物的用途。该肿瘤抗原组合是根据中国人群肝癌患者肝癌组织中肿瘤抗原表达谱，以及肿瘤抗原在其他组织中的表达水平，综合分析选择而来。在中国肝癌患者中，至少高表达本发明专利技术中的肿瘤抗原组合的一种。使用本发明专利技术报道的肿瘤抗原组合物，可以直接负载DC细胞，制备成DC肿瘤疫苗，用于中国肝癌患者的免疫治疗。
A common cancer antigen composition for liver cancer and its preparation and use
The invention relates to a general liver cancer antigen composition, a specific component of the antigen composition, a preparation method and the use of the antigen composition. The tumor antigen combination is based on the tumor antigen expression profile and the expression level of tumor antigen in other tissues of liver cancer patients in China. In Chinese patients with liver cancer, at least a high expression of the combination of the tumor antigen in the present invention. The tumor antigen composition reported in the present invention can directly load DC cells and prepare a DC tumor vaccine for immunotherapy of liver cancer patients in China.
【技术实现步骤摘要】
一种通用的肝癌肿瘤抗原组合物及其制备方法和用途
本专利技术涉及生物医药领域，具体地，涉及到一种通用的肝癌肿瘤抗原组合物、该抗原组合物的具体组分、制备方法、以及该抗原组合物的用途。
技术介绍
癌症的传统治疗手段如：手术治疗、放射治疗和化疗等，均具有一定的局限性。手术治疗只适合早期肿瘤；而放疗和化疗由于靶向性较差，易损伤正常细胞，产生不良反应。恶性肿瘤具有易侵袭和易复发的生物学特征，因此需要靶向性更好、毒性更小的治疗方案。随着肿瘤学的发展，生物免疫疗法成为肿瘤治疗的第四种手段。有研究证明，肿瘤细胞具有特异性的肿瘤抗原，免疫系统能通过识别肿瘤抗原区别肿瘤细胞和正常细胞。在肿瘤患者中，免疫系统受到抑制，无法正常识别肿瘤细胞表面的肿瘤抗原，进而有效杀伤肿瘤细胞。树突细胞肿瘤疫苗通过特异性的、具有免疫原性的肿瘤抗原(如：多肽、RNA等)负载树突细胞，在各种细胞因子、趋化因子等佐剂的辅助下，激活或加强机体自身抗肿瘤免疫，进而杀伤和清除肿瘤细胞。目前，树突细胞肿瘤疫苗已成为肿瘤治疗领域的研究热点。由于肿瘤具有高度异质性，不同的患者，甚至同一个患者的不同部位的肿瘤，其表达的肿瘤抗原各不相同。目前，针对需要进行肿瘤疫苗接种的患者，需要取患者自身新鲜的肿瘤组织和正常组织，进行肿瘤抗原表达谱分析，筛选出个体化的肿瘤抗原后，根据肿瘤抗原表达谱进行肿瘤疫苗的制备。现有的技术，整个肿瘤疫苗制备过程成本高，所需时间长，侵入式的取样对患者伤害较大，而且对于无法手术或者不适合穿刺取样的患者，无法得到特异肿瘤抗原，进行肿瘤疫苗制备。基于此，我们
技术实现思路
针对上述的相关技术问题，根据已有的肝癌相关抗原信息，从中筛选了在正常组织中无表达或者低表达基因，并且在中国人肝癌组织以及正常组织中进行表达水平检测，根据这些肿瘤抗原在中国人群肝癌组织中相对正常组织中的表达水平，筛选出了一种肿瘤抗原组合。本专利技术公开的肿瘤抗原组合在中国肝癌患者中，至少有一种抗原在肿瘤组织中特异性高表达。需要进行肿瘤疫苗治疗的患者，不再需要进行肿瘤抗原表达水平分析，直接使用本抗原组合进行肿瘤疫苗的制备，能够节省肿瘤疫苗制备时间，降低成本，且无需手术或者穿刺取样，可以减轻患者痛苦，扩大肿瘤疫苗适用人群。本专利技术提供的抗原组合物，其制备方法包括以下步骤：1.根据Genebank数据库的基因信息合成肿瘤抗原(GPC3，AFP，AKR1B10，EpCAM，FLVCR1)；2，将合成的肿瘤抗原分别克隆到含有T7启动子和A64ployA结构的载体上；3.以speI限制性内切酶线性化重组质粒；4.以T7RNA聚合酶体外转录合成抗原mRNA；5.将5种肿瘤抗原mRNA按照一定的比例混合，制备成备用的抗原组合。附图说明图1是本专利技术流式细胞仪检测DC细胞转染效率图图2是本专利技术流式细胞仪检测DC细胞表型图图3是本专利技术荧光定量PCR法检测肝癌肿瘤抗原组合各组分在转染后DC细胞负载情况图具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。实施例一：肝癌肿瘤抗原在中国肝癌患者肿瘤组织和正常组织中的表达水平筛查1.对已有文献报道和clinicaltrail网站注册临床试验中使用的肝癌肿瘤抗原进行调研，充分搜集资料后，确定如AFP等在正常组织中无表达或者低表达、在大多数肝癌组织中可能高表达的肿瘤抗原。2.根据各肿瘤抗原基因序列设计出特异性扩增引物，利用NCBI引物搜索软件检测各个抗原引物在人类基因组和转录组中的的特异性，得到各抗原的检测引物。3.检测模板的获得1)组织样品的选取和制备：为了保证所检测肿瘤组织的代表性，选择不同分级、性别、年龄的肝癌患者肿瘤组织和正常组织进行检测。手术切下来的肿瘤组织，切除边缘，选取中间完好的组织块，切成小块在最短的时间内放置于RNAlater中，防止RNA降解。同时选取肿瘤旁边1cm处的正常组织，按照同样的处理方式保存在RNAlater中。2)称取20mgRNAlater保存的肿瘤组织和癌旁组织样品，加入1mlTrizol试剂充分研磨，使组织块充分裂解，按照Trizol试剂说明书所述提取样品总RNA。3)使用nanodrop2000核酸定量仪准确定量组织样品总RNA浓度，按照cDNA反转录试剂盒说明书所述，使用oligo(dT)合成模板cDNA。4.使用SYBRqPCRMix配制反应体系，在各个样品中对选择的肿瘤抗原进行qRT-PCR扩增，同时用人的内参基因GAPDH进行qRT-PCR扩增各组织样品，以确保总RNA提取质量以及获得的cDNA质量。5.根据qRT-PCR扩增情况，得到相应抗原基因的Ct值，根据该样品GAPDH的扩增情况，计算出相对该肿瘤样品GAPDH的相对表达，才用2^-ddCt法计算出不同肿瘤抗原相对自身正常组织的表达情况。6.回收各个肿瘤抗原基因的qRT-PCR产物，测定各个产物的序列。根据测序结果，以及各个肿瘤抗原基因序列进行整体的序列分析，以确定qRT-PCR扩增的准确性。7.综合分析各个肿瘤抗原在不同肿瘤样品相对自身正常组织的表达情况，筛选出在中国肝癌患者肿瘤组织中相对表达水平最高，高表达比例最多的一群基因，如AFP，GPC3，AKR1B10等，作为一种通用的肝癌肿瘤抗原组合。实施例二：通用型肝癌肿瘤抗原组合物的制备本专利技术提供了一种肿瘤抗原组合物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：1.；2，将合成的肿瘤抗原分别克隆到含有T7启动子和A64ployA结构的载体上；3.以speI限制性内切酶线性化重组质粒；4.以T7RNA聚合酶体外转录合成抗原信使RNA；5.将5种肿瘤抗原信使RNA按照一定的比例混合，制备成备用的抗原组合。1.根据Genebank数据库的基因信息合成肿瘤抗原基因(GPC3，AFP，AKR1B10，EpCAM，FLVCR1)，分别克隆合成后的重组基因到载体psp73上。2.将合成的重组抗原质粒转化大肠杆菌感受态细胞stb13中，过夜培养扩增后，使用无内毒素质粒提取试剂盒提取重组质粒。3.将提取的重组质粒按照如下体系进行酶切(以100ul体系为例)：10xCutsmartbuffer，10ul；重组质粒DNA(1000ng/ul)，50ul；超纯水，35ul；SpeI-HF限制性内切酶，5ul。充分混匀后于37℃反应2～3小时。4.酶切产物中加入70ul异丙醇，充分混匀后放于-20℃沉淀30分钟。5.以14000RPM，4℃离心10分钟，沉淀DNA。去上清，以1ml75％乙醇洗沉淀两次。6.加入30ul超纯水溶解DNA沉淀，以核酸定量仪检测DNA浓度，用超纯水将浓度稀释到1ug/ul，得到speI酶线性化的重组质粒。7.以线性化的重组质粒为模板，进行体外转录合成抗原mRNA(以20ul反应体系为例)：2xNTP/ARCA，10ul；10xbuffer，2ul；线性化的重组质粒模板(1ug/ul)，1ul；超纯水，5ul；T7体外转录酶，2ul。充分混匀后于37℃反应2～3小时。8.加入30ulLiCl(7.5M)，充分混匀后，于-20℃静置30分钟沉淀mRNA。9.以14000RPM，4℃离心10～15分钟，沉淀抗原mRNA。去上清，以1ml75％乙醇洗沉淀两次。10.加入20ul无核酸酶的超纯水，充分溶解RNA后，以核酸定量仪检测m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通用的肝癌特异性肿瘤抗原组合物，其特征在于所述组合物由表达下列肿瘤抗原的mRNA组成：人GPC3基因，人AFP基因，人AKR1B10基因，人EpCAM基因，和人FLVCR1基因。
【技术特征摘要】
1.一种通用的肝癌特异性肿瘤抗原组合物，其特征在于所述组合物由表达下列肿瘤抗原的mRNA组成：人GPC3基因，人AFP基因，人AKR1B10基因，人EpCAM基因，和人FLVCR1基因。2.权利要求1所述的肿瘤抗原组合，其中肿瘤抗原为mRNA形式。3.权利要求1所述的肿瘤抗原组合，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：北京启辰生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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