一种人工合成的植物抗虫蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种人工合成的植物抗虫蛋白及其制备方法和应用。本发明专利技术提供一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明专利技术对野生型苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白编码基因(Cry51Aa1基因)序列进行密码子优化改造，得到优化后的RLTP基因，将该优化后的基因表达蛋白，可以起到杀虫的效果，将该基因转化到植物中，得到抗虫性显著提高的转基因植物，为植物虫害的治理提供广阔的应用前景，也为植物的抗虫基因工程研究与开发提供一种高效杀虫蛋白基因。

【技术实现步骤摘要】
一种人工合成的植物抗虫蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种人工合成的植物抗虫蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
植物虫害是导致农作物损失的主要因素，给农民造成重大的经济损失，甚至影响到当地人口的生存状况。广谱化学杀虫剂已被广泛用于控制具有重要农业意义的害虫，但带来的环境问题又阻碍了杀虫剂的进一步应用。使用生物控制各种害虫在一定情况下是可行的，最好的例子是来自革兰氏阳性菌苏云金芽孢杆菌(BacillusThruingiensis,Bt)的δ-内毒素。这种杀虫蛋白被用作生物杀虫制剂可有效地对抗许多鳞翅目害虫。但使用Bt杀虫制剂的重要限制是这种杀虫蛋白在环境中容易被降解，在生产上要重复施用，大大增加了成本从而为农业生产的实际应用带来困难，造成这些生物制剂的应用有限。近年来，随着转Bt基因棉在我国的大面积种植，棉铃虫得到了有效控制，但由于棉田中减少了化学药剂的使用，盲蝽蟓上升为主要害虫，同时由于农业产业结构调整，果树和蔬菜的种植面积大幅度增加，为盲蝽蟓提供了丰富的寄主植物和适宜的越冬场所，发生危害日趋严重。盲蝽蟓的寄主范围非常广泛，有38科147种之多，其中主要有锦葵科、豆科、菊科、十字花科及多种果树林木等，在田间有转主危害的特征，且具有发生世代长、世代重叠严重的特点，在田间十分活跃，活动隐蔽，给防治带来了很大困难。目前对盲蝽蟓的防治仍以化学防治为主，但杀虫剂的短期使用会使盲蝽蟓产生亚致死效应，长期不合理使用会导致抗药性的发生，从而加大防治难度。从棉花出苗到拔棉柴，棉蓟马的危害贯穿棉花一生。除棉花根部，棉蓟马危害棉株所有器官。所以症状和后果多种多样。幼苗期暴发可造成大量无头苗和多头苗；蕾期暴发可造成茎秆畸形、叶功能受损和幼蕾脱落；花铃期暴发可严重影响叶功能，造成严重和过度早衰。由于小虫在棉株上广泛分布，后期植株高大、器官交错，对喷药质量要求很高，很难得到满足。所以它经受各种农药的打击杀伤压力，大于其他害虫。现在保存下来的种群，都是对常用农药抗耐能力很强的。这给用药防治增加了很大难度。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种蛋白质。本专利技术提供的蛋白质，命名为RLTP(ResistantLygocorislucorumandThripsSchrankprotein)蛋白，是如下(a)-(d)中任一种蛋白质：(a)其氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列；(b)其氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；(c)将(a)或(b)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗虫功能的由(a)或(b)衍生的蛋白质；(d)与(a)或(b)限定的蛋白质至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有抗虫功能的蛋白。其中，序列2由309个氨基酸残基组成。上述(b)中的RLTP蛋白可先合成其编码基因(序列1)，再进行生物表达得到。上述(b)中的RLTP蛋白的编码基因可通过将序列1的第1-930位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。编码上述蛋白的核酸分子也是本专利技术保护的范围。本专利技术提供的核酸分子为如下1)-4)中任一所述核酸分子：1)编码区包括序列表中序列2所示的核酸分子；2)编码区由序列表中序列2所示的核酸分子组成；3)在严格条件下与1)或2)限定的核酸序列杂交且编码具有抗虫功能蛋白质的核酸分子；4)与1)或2)限定的核酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有抗虫功能蛋白质的核酸分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体具体为在pBI121表达载体的BamHI和SacI位点插入序列表中序列1所示的DNA分子得到的重组表达载体。或所述重组载体为将序列表中序列1所示DNA分子插入pHT304载体HindIII和SacI位点间得到的载体，表达蛋白RLTP。上述蛋白、上述核酸分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物抗虫性中的应用也是本专利技术保护的范围；或，上述蛋白、上述核酸分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在杀虫中的应用也是本专利技术保护的范围。或上述蛋白、上述核酸分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育抗虫性提高转基因植物中的应用也是本专利技术保护的范围。或上述蛋白、上述核酸分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备杀虫剂或防虫害制剂中的应用也是本专利技术保护的范围。上述应用中，所述虫为刺吸式害虫；或，所述虫为刺吸式害虫，所述刺吸式害虫具体为盲蝽蟓和/或棉蓟马；或所述植物为双子叶植物或单子叶植物。本专利技术的另一个目的是提供一种杀虫剂或防虫害制剂。本专利技术提供的杀虫剂或防虫害制剂，其活性成分为上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。本专利技术第3个目的是提供一种培育抗虫性提高转基因植物的方法或提供一种提高植物抗虫性的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：提高植物中编码上述蛋白的DNA分子的表达量或活性，获得转基因植物，所述转基因植物的抗虫性高于所述目的植物。上述方法中，所述提高编码上述蛋白的DNA分子的表达量或活性为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物。上述方法中，所述虫为刺吸式害虫；或，所述虫为刺吸式害虫，所述刺吸式害虫具体为盲蝽蟓和/或棉蓟马；或所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物为烟草或棉花，涉及到利用该基因为进行抗虫工程的各种植物，包括大田作物、蔬菜和瓜果类等植物。本专利技术对野生型苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白编码基因(Cry51Aa1基因)序列进行密码子优化改造，得到优化后的RLTP基因，其能显著的提高RLTP抗虫蛋白在植物中的表达量和稳定性，从而使RLTP蛋白在细胞内得到积累。将该优化后的基因表达蛋白，可以起到杀虫的效果，将该基因转化到植物中，得到抗虫性显著提高的转基因植物，为植物虫害的治理提供广阔的应用前景，也为植物的抗虫基因工程研究与开发提供一种高效杀虫蛋白基因。附图说明图1为重组原核表达载体pHTRLTP的构建过程。图2为重组植物表达载体pBIRLTP的构建过程。图3为诱导蛋白SDS-PAGE电泳图谱。图4为PCR检测转基因棉花电泳图谱。图5为半定量RT-PCR电泳图谱。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、抗虫蛋白RLTP的获得下述所有基因操作方法均参照《分子克隆》(SambrookJ等人，1989)所述进行；所用限制性内切酶和其它工具酶均购自大连TaKaRa公司。一、抗虫蛋白基因RLTP的获得1、抗虫蛋白RLTP的人工设计密码子优化和氨基酸改变野生型Cry51Aa1基因序列，具体为：根据Gen本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，是如下(a)‑(d)中任一种蛋白质：(a)其氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列；(b)其氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；(c)将(a)或(b)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗虫功能的由(a)或(b)衍生的蛋白质；(d)与(a)或(b)限定的蛋白质至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有抗虫功能的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，是如下(a)-(d)中任一种蛋白质：(a)其氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列；(b)其氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；(c)将(a)或(b)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗虫功能的由(a)或(b)衍生的蛋白质；(d)与(a)或(b)限定的蛋白质至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有抗虫功能的蛋白。2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)-4)中任一所述核酸分子：1)编码区包括序列表中序列2所示的核酸分子；2)编码区由序列表中序列2所示的核酸分子组成；3)在严格条件下与1)或2)限定的核酸序列杂交且编码具有抗虫功能蛋白质的核酸分子；4)与1)或2)限定的核酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有抗虫功能蛋白质的核酸分子。4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。或，扩增权利要求2或3所述核酸分子全长或其任意片段的引物对。5.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物抗虫性中的应用；或，权利要求1所述蛋白、权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴家和，胡广，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11