用于监测细胞中生物分子的定位和运输的生物传感器制造技术

公开了用于评估蛋白如受体和其他生物分子如第二信使的胞内定位、内化和运输至细胞区室的生物发光共振能量转移(BRET)生物传感器。这些依赖于细胞区室中BRET供体和受体的浓度/密度而非特异性蛋白‑蛋白相互作用的生物传感器使用海肾GFP/Luc BRET对，其允许稳健和可再现地监测蛋白运输/定位，具有与高通量筛选(HTS)相适应的灵敏性。还公开了这些生物传感器用于各种应用的用途，包括评估/监测蛋白的胞吞作用、回收和胞内运输、通过药物分子伴侣的受体成熟/拯救、各种胞吞作用/胞吐作用过程、激活/抑制以及不同细胞区室中的生物分子浓度/密度。

Biosensors used to monitor the location and transport of biomolecules in cells

A bioluminescence resonance energy transfer (BRET) biosensor for evaluating intracellular localization, internalization and transport to cell compartment of proteins, such as receptors and other biomolecules, such as second messengers, has been published. The biosensor concentration / these depend on the BRET cell compartment in the donor and acceptor density and non specific protein protein interactions using Renilla GFP/Luc BRET on, which allows robust and reproducible monitoring of protein transport / localization, has with high-throughput screening (HTS) sensitivity to fitthe. Also disclosed these biosensors for use in a variety of applications, including the assessment / monitoring of protein endocytosis and recycling and intracellular transport, through pharmacological chaperones rescue, various receptor maturation / endocytosis / exocytosis process, activation / inhibition / biological molecular concentration and different cellular compartments in density.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于监测细胞中生物分子的定位和运输的生物传感器相关申请的交叉引用本申请要求于2014年9月19日提交的美国临时申请号62/052,738的权益，其通过引用全文并入本文。
本专利技术一般地涉及生物分子如蛋白质的定位、运输和运输，例如受体和效应物的细胞表面受体胞吞作用、回收和胞内运输的评估/监测。
技术介绍
蛋白运输是蛋白质从细胞的一个区域至另一个区域的重定位的活动过程。膜和其蛋白组件通过具有多组件和途径的机制被不断地移位。调节细胞表面受体如G蛋白偶联受体(GPCR)和表皮生长因子受体(EGFR)的活性的机制之一是通过受体胞吞作用。对于GPCR，配体诱导的受体胞吞作用可以驱动受体通过特化的区室如披网格蛋白小泡(clathrin-coatedvesicles)从PM移除，这与胞吞衔接体(adaptor)β-抑制蛋白至相配的受体的募集有关(Claing,Laporte等人.2002)。可以将内化受体引导至分开的溶酶体途径和回收途径，产生对通过异源三聚体G蛋白的细胞信号传导的强度和持续时间的本质上相反的作用，并且可以通过β-抑制蛋白的信号传导骨架促进来自细胞内膜的不同的信号传导事件(Hanyaloglu和vonZastrow2008；Posner和Laporte2010)。已经提出了促进GPCR/β-抑制蛋白复合体的胞内靶向的药物的治疗优势，同时对于某些受体来说，其回收至PM对充分保持生理响应也是必要的。因此，用于监测受体运输的简单可靠的系统对于研究受体胞吞的机制和开发作用于细胞表面受体如GPCR的有效治疗剂是关键的。例如，血管紧张素II1型受体(AT1R)吸引了药物开发的重点关注，这是因为其与心血管疾病(包括高血压、肥大、纤维化和动脉粥样硬化)的发展有关，以及具有心脏保护功能的配体也可以促进受体和胞内AT1R/β-抑制蛋白信号传导复合物的内化。因此，开发以定量和高效方式有效评估药物诱导受体如GPCR的内化的倾向可以产生巨大的优势。本描述参考许多文献，所述文献的内容通过引用全文并入本文。
技术实现思路
本专利技术涉及以下的1至73个项目：1.用于评估感兴趣的蛋白的运输和/或定位的生物传感器，包括：第一组件，所述第一组件包括用海肾绿色荧光蛋白(海肾GFP)或海肾荧光素酶蛋白(海肾Luc)标记的所述感兴趣的蛋白；第二组件，所述第二组件包括用海肾GFP或海肾Luc标记的细胞区室靶向部分；其中如果所述第一蛋白用所述海肾GFP标记，则所述细胞区室靶向部分用所述海肾Luc标记，如果所述第一蛋白用所述海肾Luc标记，则所述细胞区室靶向部分用所述海肾GFP标记。2.项目1所述的生物传感器，其中所述感兴趣的蛋白用所述海肾Luc标记，所述细胞区室靶向部分用所述海肾GFP标记。3.项目1或2所述的生物传感器，其中所述感兴趣的蛋白是Rho结合多肽、β-抑制蛋白多肽、细胞表面受体或G蛋白亚基多肽。4.项目3所述的生物传感器，其中所述感兴趣的蛋白是Rho结合多肽。5.项目3所述的生物传感器，其中所述感兴趣的蛋白是细胞表面受体。6.项目5所述的生物传感器，其中所述细胞表面受体是G蛋白偶联受体(GPCR)。7.项目1至6中任一项所述的生物传感器，其中所述细胞区室靶向部分是质膜(PM)靶向部分、内体靶向部分、高尔基体靶向部分、溶酶体靶向部分、过氧化物酶体靶向部分、自噬体靶向部分、核糖体靶向部分、线粒体靶向部分、细胞骨架靶向部分或细胞核靶向部分。8.项目7所述的生物传感器，其中所述细胞区室靶向部分是质膜(PM)靶向部分。9.项目8所述的生物传感器，其中所述PM靶向部分是定位于PM中的PM蛋白或其片段。10.项目9所述的生物传感器，其中所述PM蛋白或其片段包括(a)棕榈酰化信号序列、豆蔻酰化信号序列和/或异戊烯化信号序列，和/或(b)多碱序列。11.项目10所述的生物传感器，其中所述棕榈酰化信号序列和/或豆蔻酰化信号序列来自人Src家族激酶Lyn。12.项目11所述的生物传感器，其中所述PM靶向部分包括氨基酸序列MGCIKSKGKDS(SEQIDNO:1)。13.项目12所述的生物传感器，其中所述多碱序列和异戊烯化信号序列来自人KRAS剪接变体b。14.项目13所述的生物传感器，其中所述PM靶向部分包括氨基酸序列GKKKKKKSKTKCVIM(SEQIDNO:7)。15.项目10所述的生物传感器，其中所述PM靶向部分包括来自hRas的棕榈酰化序列和异戊烯化信号序列。16.项目15所述的生物传感器，其中所述PM靶向部分包括氨基酸序列CMSCKCVLS(SEQIDNO:47)。17.项目10所述的生物传感器，其中所述PM靶向部分包括来自hRas的棕榈酰化序列和来自Ral1的异戊烯化信号序列。18.项目17所述的生物传感器，其中所述PM靶向部分包括氨基酸序列CMSCKCCIL(SEQIDNO:43)。19.项目9所述的生物传感器，其中所述PM蛋白或其片段是小窝蛋白1α。20.项目10所述的生物传感器，其中所述PM靶向多碱序列来自人GRK5。21.项目20所述的生物传感器，其中所述PM靶向部分包括氨基酸序列SPKKGLLQRLFKRQHQNNSKS(SEQIDNO:8)。22.项目8至21所述的生物传感器，其中(i)所述PM靶向部分包括来自人Src家族激酶Lyn的棕榈酰化信号序列和/或豆蔻酰化信号序列，并且所述PM靶向部分融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的N端，或(ii)所述PM靶向部分包括(a)来自人KRAS剪接变体b或HRAS的多碱序列和异戊烯化信号序列；(b)来自HRAS的棕榈酰化序列和来自Ral1的异戊烯化信号序列；(c)小窝蛋白1α或其片段；或(d)来自人GRK5的多碱序列，并且所述PM靶向部分融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的C端。23.项目7所述的生物传感器，其中所述细胞区室靶向部分是内体靶向部分。24.项目23所述的生物传感器，其中所述内体靶向部分是定位于内体的内体蛋白或其片段。25.项目24所述的生物传感器，其中所述内体蛋白或其片段包括FYVE域。26.项目23至25中任一项所述的生物传感器，其中所述内体靶向部分包括人内体相关蛋白(endofin)的FYVE域。27.项目26所述的生物传感器，其中所述内体靶向部分包括人内体相关蛋白的第739～806位残基(SEQIDNO:20)。28.项目23所述的生物传感器，其中所述内体蛋白或其片段是Rab蛋白或其片段。29.项目28所述的生物传感器，其中所述Rab蛋白是Rab4或Rab11。30.项目23至29中任一项所述的生物传感器，其中所述内体靶向部分融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的C端。31.项目23至30中任一项所述的生物传感器，其中所述感兴趣的蛋白融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的N端。32.项目7所述的生物传感器，其中所述细胞区室靶向部分是高尔基体靶向部分。33.项目32所述的生物传感器，其中所述高尔基体靶向部分是定位于高尔基体的高尔基体蛋白或其片段。34.项目33所述的生物传感器，其中所述高尔基体靶向部分是定位于高尔基体的eNOS1或其片段。35.项目34所述的生物传感器，其中所述高尔基体靶向部分包括人eNOS1的第1～73位残基(SEQIDNO:42)。36.项目1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于评估感兴趣的蛋白的运输和/或定位的生物传感器，其包括：第一组件，所述第一组件包括用海肾(Renilla)绿色荧光蛋白(海肾GFP)或海肾(Renilla)荧光素酶蛋白(海肾Luc)标记的所述感兴趣的蛋白；第二组件，所述第二组件包括用海肾GFP或海肾Luc标记的细胞区室靶向部分；其中，如果所述第一蛋白用所述海肾GFP标记，则所述细胞区室靶向部分用所述海肾Luc标记，如果所述第一蛋白用所述海肾Luc标记，则所述细胞区室靶向部分用所述海肾GFP标记。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.19 US 62/052,7381.一种用于评估感兴趣的蛋白的运输和/或定位的生物传感器，其包括：第一组件，所述第一组件包括用海肾(Renilla)绿色荧光蛋白(海肾GFP)或海肾(Renilla)荧光素酶蛋白(海肾Luc)标记的所述感兴趣的蛋白；第二组件，所述第二组件包括用海肾GFP或海肾Luc标记的细胞区室靶向部分；其中，如果所述第一蛋白用所述海肾GFP标记，则所述细胞区室靶向部分用所述海肾Luc标记，如果所述第一蛋白用所述海肾Luc标记，则所述细胞区室靶向部分用所述海肾GFP标记。2.权利要求1所述的生物传感器，其中，所述感兴趣的蛋白用所述海肾Luc标记，所述细胞区室靶向部分用所述海肾GFP标记。3.权利要求1或2所述的生物传感器，其中，所述感兴趣的蛋白是Rho结合多肽、β-抑制蛋白多肽、细胞表面受体或G蛋白亚基多肽。4.权利要求3所述的生物传感器，其中，所述感兴趣的蛋白是Rho结合多肽。5.权利要求3所述的生物传感器，其中，所述感兴趣的蛋白是细胞表面受体。6.权利要求5所述的生物传感器，其中，所述细胞表面受体是G蛋白偶联受体(GPCR)。7.权利要求1至6中任一项所述的生物传感器，其中，所述细胞区室靶向部分是质膜(PM)靶向部分、内体靶向部分、高尔基体靶向部分、溶酶体靶向部分、过氧化物酶体靶向部分、自噬体靶向部分、核糖体靶向部分、线粒体靶向部分、细胞骨架靶向部分或细胞核靶向部分。8.权利要求7所述的生物传感器，其中，所述细胞区室靶向部分是质膜(PM)靶向部分。9.权利要求8所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分是定位于所述PM的PM蛋白或其片段。10.权利要求9所述的生物传感器，其中，所述PM蛋白或其片段包括(a)棕榈酰化信号序列、豆蔻酰化信号序列和/或异戊二烯化信号序列，和/或(b)多碱序列。11.权利要求10所述的生物传感器，其中，所述棕榈酰化信号序列和/或豆蔻酰化信号序列来自人Src家族激酶Lyn。12.权利要求11所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分包括氨基酸序列MGCIKSKGKDS(SEQIDNO：1)。13.权利要求12所述的生物传感器，其中，所述多碱序列和异戊二烯化信号序列来自人KRAS剪接变体b。14.权利要求13所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分包括氨基酸序列GKKKKKKSKTKCVIM(SEQIDNO：7)。15.权利要求10所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分包括来自hRas的棕榈酰化序列和异戊二烯化信号序列。16.权利要求15所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分包括氨基酸序列CMSCKCVLS(SEQIDNO：47)。17.权利要求10所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分包括来自hRas的棕榈酰化序列和来自Ral1的异戊二烯化信号序列。18.权利要求17所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分包括氨基酸序列CMSCKCCIL(SEQIDNO：43)。19.权利要求9所述的生物传感器，其中，所述PM蛋白或其片段是小窝蛋白1α。20.权利要求10所述的生物传感器，其中，所述PM靶向多碱序列来自人GRK5。21.权利要求20所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分包括氨基酸序列SPKKGLLQRLFKRQHQNNSKS(SEQIDNO：8)。22.权利要求8至21所述的生物传感器，其中，(i)所述PM靶向部分包括来自人Src家族激酶Lyn的棕榈酰化信号序列和/或豆蔻酰化信号序列，并且所述PM靶向部分融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的N端；或(ii)所述PM靶向部分包括：(a)来自人KRAS剪接变体b或HRAS的多碱序列和异戊二烯化信号序列；(b)来自HRAS的棕榈酰化序列和来自Ral1的异戊二烯化信号序列；(c)小窝蛋白1α或其片段；或(d)来自人GRK5的多碱序列，并且所述PM靶向部分融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的C端。23.权利要求7所述的生物传感器，其中，所述细胞区室靶向部分是内体靶向部分。24.权利要求23所述的生物传感器，其中，所述内体靶向部分是定位于内体的内体蛋白或其片段。25.权利要求24所述的生物传感器，其中，所述内体蛋白或其片段包括FYVE域。26.权利要求23至25中任一项所述的生物传感器，其中，所述内体靶向部分包括人内体相关蛋白的FYVE域。27.权利要求26所述的生物传感器，其中，所述内体靶向部分包括人内体相关蛋白的第739～806位残基(SEQIDNO：20)。28.权利要求23所述的生物传感器，其中，所述内体蛋白或其片段是Rab蛋白或其片段。29.权利要求28所述的生物传感器，其中，所述Rab蛋白是Rab4或Rab11。30.权利要求23至29中任一项所述的生物传感器，其中，所述内体靶向部分融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的C端。31.权利要求23至30中任一项所述的生物传感器，其中，所述感兴趣的蛋白融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的N端。32.权利要求7所述的生物传感器，其中，所述细胞区室靶向部分是高尔基体靶向部分。33.权利要求32所述的生物传感器，其中，所述高尔基体靶向部分是定位于高尔基体的高尔基体蛋白或其片段。34.权利要求33所述的生物传感器，其中，所述高尔基体靶向部分是定位于高尔基体的eNOS1或其片段。35.权利要求34所述的生物传感器，其中，所述高尔基体靶向部分包括人eNOS1的第1～73位残基(SEQIDNO：42)。36.权利要求1至35中任一项所述的生物传感器，其中，所述第一组件和第二组件通过柔性接头共价连接。37.权利要求36所述的生物传感器，其中，所述柔性接头是约50～约500个氨基酸的多肽。38.权利要求37所述的生物传感器，其中，所述柔性接头是约300个氨基酸的多肽。39.一种核酸，编码权利要求1至38中任一项所述的生物传感器的第一组件和/或第二组件。40.一种载体，包括权利要求39所述的核酸。41.一种宿主细胞，表达权利要求1至38中任一项所述的生物传感器。42.一种用于确定试剂是否调节细胞中感兴趣的蛋白的运输的方法，所述方法包括：测量在存在和不存在所述试剂的情况下权利要求1至38中任一项所述的生物传感器中的BRET信号；其中，存在所述试剂的情况下与不存在所述试剂的情况下的所述BRET信号的差异表明所述试剂调节细胞中所述感兴趣的蛋白的运输。43.一种用于确定试剂是否诱导细胞中感兴趣的细胞表面受体的内化的方法，所述方法包括：测...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯特凡娜·阿兰·拉波特，允·南孔，米歇尔·布维耶，克里斯蒂安·勒古耶，米雷耶·霍格，维多利亚·卢卡舍瓦，小林弘幸，丹尼斯·德布卢瓦，艾蒂安·迪雷特，
申请(专利权)人：皇家学习促进会麦吉尔大学，蒙特利尔大学，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA