一种复合凝胶的制备方法及其在诱导干细胞成软骨分化中的应用技术

本发明专利技术公开了一种复合凝胶的制备方法及其在诱导干细胞成软骨分化中的应用，所述方法包括如下步骤：(1)胶原的制备，采用浓度为0.4‑0.6M醋酸作为溶剂制备浓度为10‑20mg/mL的无菌牛皮胶原冻干品‑醋酸溶液；(2)京尼平原液的制备；(3)取一定体积由步骤(1)制备的胶原并加入一定体积的由步骤(2)制备的京尼平原液和碳点，制备浓度分别为0.4‑2vol％的京尼平和碳点的混合液，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平‑胶原‑碳点复合凝胶。本发明专利技术通过说明经过京尼平交联之后，碳点的ROS释放受到限制，将碳点释放的ROS控制在低量状态，发挥其对细胞增殖和分化的促进作用，并且保持碳点的作用的时效，且该复合凝胶可应用于诱导干细胞分化成软骨细胞。

The preparation of a compound gel and its application in the induction of chondrogenic differentiation of stem cells

The invention discloses a method for preparing a composite gel and its application in inducing stem cell differentiation into cartilage. The method comprises the following steps: (1) collagen preparation, the concentration of 0.4 0.6M acetic acid as solvent to prepare the concentration of 10 20mg/mL sterile lyophilized calf collagen acetate solution; (2) Beijing, plain liquid preparation; (3) a certain volume by the step (1) preparation of collagen and adding a certain volume of the step (2) preparation of Beijing, plain liquid and carbon, preparation of mixture concentration were 0.4 2vol% genipin and carbon the point, after fully mixed in the constant temperature of 37 DEG C under the condition of static 15 minutes, get the genipin collagen carbon composite gel. The present invention by stating that after genipin, carbon release of ROS is limited, will release the ROS carbon control in low volume, play its role in promoting cell proliferation and differentiation, and keep the aging point carbon effect, and the composite gel can be used to induce stem cells to differentiate into chondrocytes.

【技术实现步骤摘要】
一种复合凝胶的制备方法及其在诱导干细胞成软骨分化中的应用
本专利技术涉及医学和生物医学工程领域，具体地涉及京尼平-胶原-碳点复合凝胶的制备方法及其在诱导干细胞向软骨分化中的应用。
技术介绍
关节软骨缺损一直是骨科临床的治疗难题，主要是因为关节软骨没有供血，且软骨细胞埋于稠厚的细胞外基质中，无法移动到损伤部位参与修复。传统的治疗方法如关节内清理和灌洗术等难以获得满意的临床效果。组织工程技术通过种子细胞符合支架材料构建组织工程化软骨，植入到缺损部位而实现治疗目的。近年来，随着纳米技术的兴起，其结合组织工程技术相结合应用于再生医学领域正在形成一个崭新的研究方向。碳点(CDots)是一种荧光纳米材料，具有光致发光特性、优良的光学稳定性及无毒性。在激光作用下，碳点能产生一定量的ROS，其中低浓度的ROS可以激活转录因子并促进细胞增殖、分化；而中、高浓度的ROS通过细胞应激反应诱导细胞凋亡甚至导致细胞坏死。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的目的之一在于提供一种京尼平-胶原-碳点复合凝胶的制备方法，方便用药。为实现上述目的，本专利技术的技术方案是：一种复合凝胶的制备方法，包括如下步骤：(1)胶原的制备，采用浓度为0.4-0.6M醋酸作为溶剂加入一定量的无菌牛皮胶原冻干片制备浓度为10-20mg/mL的无菌牛皮胶原冻干品-醋酸溶液，待无菌牛皮胶原冻干品充分溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；(2)京尼平原液的制备，取一定量的京尼平完全溶于无水乙醇中，并加入PBS定容，制备浓度为60-200mg/mL的京尼平原液(3)复合凝胶的制备，取一定体积由步骤(1)制备的胶原并加入一定体积的由步骤(2)制备的京尼平原液和碳点，制备浓度分别为0.4-2vol％的京尼平和碳点的混合液，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平-胶原-碳点复合凝胶。上述技术方案的有益效果在于：采用京尼平和胶原联合制作复合有碳点的生物材料，方便碳点作为外用药物，而且经过京尼平交联后的胶原负载碳量子点后其ROS释放比单纯的碳量子点与胶原混合后的量降低，说明经过京尼平交联之后，碳点的ROS释放受到限制，减少过多的ROS产生对细胞或机体产生毒性，而是控制碳点释放的ROS处于低量状态，发挥其对细胞增殖和分化的促进作用，并且保持碳点的作用的时效。进一步的，上述技术方案中，具体的，包括如下步骤：(1)胶原的制备，采用浓度为0.45-0.55M醋酸作为溶剂加入一定量的无菌牛皮胶原冻干片制备浓度为12-18mg/mL的无菌牛皮胶原冻干品-醋酸溶液，待无菌牛皮胶原冻干品充分溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；(2)京尼平原液的制备，取一定量的京尼平完全溶于无水乙醇中，并加入PBS定容，制备浓度为100-160mg/mL的京尼平原液；(3)复合凝胶的制备，取一定体积由步骤(1)制备的胶原并加入一定体积的由步骤(2)制备的京尼平原液和碳点，制备浓度分别为0.7-1.3vol％的京尼平和碳点的混合液，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平-胶原-碳点复合凝胶。上述技术方案的有益效果在于：调整京尼平、胶原和碳点的配比进一步的提高其疗效。更进一步的，上述技术方案中，具体的，包括如下步骤：(1)胶原的制备，采用浓度为0.5M醋酸作为溶剂加入一定量的无菌牛皮胶原冻干片制备浓度为15mg/mL的无菌牛皮胶原冻干品-醋酸溶液，待无菌牛皮胶原冻干品充分溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；；(2)京尼平原液的制备，取一定量的京尼平完全溶于无水乙醇中，并加入PBS定容，制备浓度为133mg/mL的京尼平原液；(3)复合凝胶的制备，取一定体积由步骤(1)制备的胶原并加入一定体积的由步骤(2)制备的京尼平原液和碳点，制备浓度分别为1vol％的京尼平和碳点的混合液，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平-胶原-碳点复合凝胶。上述技术方案的有益效果在于：进一步的调整京尼平、胶原和碳点的配比进一步的提高其疗效。上述技术方案中所述步骤(2)中所述京尼平与无水乙醇的用量比为1mg京尼平对应1-3μL的无水乙醇。上述技术方案的有益效果在于，使用乙醇将京尼平完全溶解。本专利技术的目的之二在于提供一种如上所述方法制备的复合凝胶在诱导干细胞成软骨分化中的应用。上述技术方案的有益效果在于：通过京尼平抑制碳点对ROS的释放量并延长碳点释放ROS的时效，确保ROS长期处于一种低水平状态，从而长期发挥其对促进细胞增殖和分化的作用，达到诱导干细胞分化为软骨细胞。附图说明图1为用京尼平-胶原交联碳点后的红外图谱；图2为京尼平-胶原-碳点复合凝胶的XRD图；图3各组分材料及复合材料溶胀率；图4各组分材料及复合材料降解率图5各组分材料及复合材料荧光强度；图6各组分材料及复合材料ROS释放度；图7各组分材料及复合材料储能模量的动态力学；图8各组分材料及复合材料损耗模量的动态力学；图9各组分材料软骨对ACAN因子表达；图10各组分材料软骨对COL2A1因子表达；图11各组分材料软骨对SOX9因子表达；图12各组分材料软骨对COL1A1因子表达；图13各组分材料的GAG含量。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。实施例1复合凝胶的制备，包括如下步骤：(1)胶原的制备，取15mg无菌牛皮胶原冻干品加入1mL浓度为0.5M的醋酸，经溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；(2)京尼平原液的制备，称取2mg京尼平溶解于2μL无水乙醇后加PBS定容至15μL；(3)复合凝胶的制备，取100μL由步骤(1)制备的胶原，然后加入步骤(2)制备的京尼平原液和碳点各1μL，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平-胶原-碳点复合凝胶A。实施例2复合凝胶的制备：包括如下步骤：(1)胶原的制备，取10mg无菌牛皮胶原冻干品加入1mL浓度为0.4M的醋酸，经溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；(2)京尼平原液的制备，称取2mg京尼平溶解于2μL无水乙醇后加PBS定容至15μL；(3)复合凝胶的制备，取120μL由步骤(1)制备的胶原，然后加入步骤(2)制备的京尼平原液和碳点各1.5μL，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平-胶原-碳点复合凝胶B。实施例3复合凝胶的制备：包括如下步骤：(1)胶原的制备，取20mg无菌牛皮胶原冻干品加入1mL浓度为0.6M的醋酸，经溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；(2)京尼平原液的制备，称取2mg京尼平溶解于6μL无水乙醇后加PBS定容至15μL；(3)复合凝胶的制备，取80μL由步骤(1)制备的胶原，然后加入步骤(2)制备的京尼平原液和碳点各0.5μL，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平-胶原-碳点复合凝胶C。实施例4复合凝胶的制备：包括如下步骤：(1)胶原的制备，取12mg无菌牛皮胶原冻干品加入1mL浓度为0.45M的醋酸，经溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；(2)京尼平原液的制备，称取2mg京尼平溶解于5μL无水乙醇后加PBS定容至15μL；(3)复合凝胶的制备，取110μL由步骤(1)制备的胶原，然后加入步骤(2)制备的京尼平原液和碳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复合凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)胶原的制备，采用浓度为0.4‑0.6M醋酸作为溶剂加入一定量的无菌牛皮胶原冻干片制备浓度为10‑20mg/mL的无菌牛皮胶原冻干品‑醋酸溶液，待无菌牛皮胶原冻干品充分溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；(2)京尼平原液的制备，取一定量的京尼平完全溶于无水乙醇中，并加入PBS定容，制备浓度为60‑200mg/mL的京尼平原液；(3)复合凝胶的制备，取一定体积由步骤(1)制备的胶原并加入一定体积的由步骤(2)制备的京尼平原液和碳点，制备浓度分别为0.4‑2vol％的京尼平和碳点的混合液，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平‑胶原‑碳点复合凝胶。

【技术特征摘要】
1.一种复合凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)胶原的制备，采用浓度为0.4-0.6M醋酸作为溶剂加入一定量的无菌牛皮胶原冻干片制备浓度为10-20mg/mL的无菌牛皮胶原冻干品-醋酸溶液，待无菌牛皮胶原冻干品充分溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；(2)京尼平原液的制备，取一定量的京尼平完全溶于无水乙醇中，并加入PBS定容，制备浓度为60-200mg/mL的京尼平原液；(3)复合凝胶的制备，取一定体积由步骤(1)制备的胶原并加入一定体积的由步骤(2)制备的京尼平原液和碳点，制备浓度分别为0.4-2vol％的京尼平和碳点的混合液，充分混匀后置于37℃恒温条件下静置15分钟，得到京尼平-胶原-碳点复合凝胶。2.根据权利要求1所述的复合凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)胶原的制备，采用浓度为0.45-0.55M醋酸作为溶剂加入一定量的无菌牛皮胶原冻干片制备浓度为12-18mg/mL的无菌牛皮胶原冻干品-醋酸溶液，待无菌牛皮胶原冻干品充分溶胀后，于冰上不断搅拌使胶原充分溶解；(2)京尼平原液的制备，取一定量的京尼平完全溶于无水乙醇中，并加入PBS定容，制备浓度为100-160mg/mL的京尼平原液；(3)复合凝胶的制备，取一定体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑立，赵劲民，陆真慧，秦雄，吴洋，许富本，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西,45