一种纤维素酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及酶制剂领域，具体涉及一种纤维素酶突变体及其应用。所述的纤维素酶突变体相较于野生型，其与纤维织物结合的CBD结构域发生了替换，替换后突变体的除毛和起花效果均优于野生型，取得了意料不到的技术效果。本发明专利技术提供的纤维素酶突变体可广泛应用于纺织加工领域，在pH 4.0‑8.5范围内应用，效果良好；除毛干净，对织物强力损失小；牛仔水洗，起花小，花点较小，批差稳定；且相同酶活的纤维素酶突变体的应用效果显著优于野生型，能大大节约生产成本，提高经济效益。

A cellulase mutant and its application

The present invention relates to the field of enzyme preparation, in particular to a cellulase mutant and its application. The cellulase mutant compared to the wild type, which is combined with the fabric of the CBD domain was replaced, replaced mutants of hair removal and wash out effect are better than the wild type, achieved unexpected effect. Cellulase mutants provided by the invention can be widely used in textile processing field, in the pH 4 8.5 range application, good effect; clean hair removal, fabric strength loss; denim, flower small, little flower, and the same number of poor stability; cellulose enzyme activity of the mutant was significantly better than the application effect the wild type, can greatly reduce production costs, improve economic efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种纤维素酶突变体及其应用
本专利技术涉及酶制剂领域，具体涉及一种纤维素酶突变体及其应用。
技术介绍
纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，也是最廉价的可再生资源。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，这组酶可以水解β-1,4-葡萄糖苷键，使得纤维素转变为纤维二糖和葡萄糖，纤维素酶属于一种复杂的复合物，被称为纤维素酶系。它们之间相互发生协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。纤维素酶属于糖苷水解酶，传统上被分为3类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(即纤维二糖水解酶)和β-葡萄糖苷酶。1906年，Seilliere在蜗牛的消化液中发现了纤维素酶，至今已有一百余年。随着工业的发展，纤维素酶可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、石油勘探、中药成分提取等众多领域，特别是在纺织、洗涤、造纸和生物能源等工业应用上具有重要地位。纺织工业是传统意义上的高污染行业，在追求人与环境和谐相处的今天，寻找高效率、低污染的新型纺织技术成为了一个必须解决的难题。当今的服装潮流更是追求工艺低污染、面料纯天然、穿着舒适轻盈，而纤维素酶在纺织工业上应用广泛，有着不可替代的优势和良好的发展前景。从20世纪90年代开始，酸性纤维素酶用于牛仔布的水洗整理，从而开始了纤维素酶在工业上的大规模应用，这也是目前纤维素酶应用最成功、用量最大的领域。在牛仔布的水洗整理上酸性纤维素酶具有用量少、效果快的特点，但服装返染严重；后续开发的中性纤维素酶反应条件温和而且不易返染，织物档次得到提高，已普遍代替酸性酶。但在棉织物的整理上，如去球、脱毛以及增柔等，酸性纤维素酶特别是木霉产生的纤维素酶仍具有更多的优势。利用纤维素酶对棉织物的整理并不需要纤维素酶的所有组分，如进行棉织物的脱毛、去球等整理，仅有内切酶就可产生明显的效果，但是棉织物的减量也较严重，影响了织物的强度，通过基因工程改变内切酶和外切酶的比例，可以在一定程度上解决这个问题。因此，通过基因工程手段开发更高效、低价、低污染的纤维素酶，是目前纺织行业亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种纤维素酶突变体及其高效重组表达菌株。本专利技术通过对来源于Staphylotrichumcoccosporum的纤维素酶进行蛋白质工程改造，获得了一种突变体蛋白，其在纺织除毛和水洗中的应用效果得到显著的提高，可广泛应用于纺织工业领域。本专利技术一方面提供了一种纤维素酶突变体，是氨基酸序列为SEQIDNO：1的纤维素酶第208-295位氨基酸序列替换成特异腐质霉(Humicolainsolens)来源的纤维素酶的CBD(CelluloseBindingDomain，纤维素结合域)序列。所述特异腐质霉(Humicolainsolens)来源的纤维素酶的CBD序列为SEQIDNO：3，其编码基因的核酸序列为SEQIDNO：4。所述纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO：5，其编码基因的核酸序列为SEQIDNO：6。本专利技术另一方面提供了携带有编码序列为SEQIDNO：6的纤维素酶突变体基因的重组质粒。本专利技术还涉及一种工程菌株，其携带有上述重组质粒。所述工程菌株为里氏木霉(Trichodermareesei)。本专利技术还涉及上述纤维素酶突变体在纺织领域中的应用。本专利技术所述的纤维素酶突变体SD相较于野生型，其与纤维织物结合的CBD结构域发生了替换，替换后突变体的除毛和起花效果均优于野生型，取得了意料不到的技术效果。申请人推测可能是由于CBD结构域置换导致蛋白质结构发生某种变化，使替换后的CBD结构域与织物的亲和力更高，更利于其对织物的酶促作用，进而使其应用效果得到显著提高。本专利技术提供的纤维素酶突变体可广泛应用于纺织加工领域，在pH4.0-8.5范围内应用，效果良好；除毛干净，对织物强力损失小；牛仔水洗，起花小，花点较小，批差稳定；且相同酶活的纤维素酶突变体的应用效果显著优于野生型，能大大节约生产成本，提高经济效益。附图说明图1为纤维素酶突变体与野生型摇瓶发酵SDS-PAG电泳图。具体实施方式本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本专利技术限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细描述。实施例1：纤维素酶突变体的获得为了提高野生型纤维素酶StceI(氨基酸序列为SEQIDNO:1，其编码核苷酸序列为SEQIDNO:2)在纺织用品除毛和水洗中的应用效果，提高其应用活力，申请人对该酶的CBD序列进行了大量的置换筛选。在筛选过程中，申请人发现：有些置换的CBD对该酶的应用效果没有影响，而有些CBD甚至会导致其应用效果更差了，还有些置换虽然能显著提高该酶的应用效果，但酶学性质更差，不适用于工业生产。最终，申请人筛选到一种既能使该纤维素酶的应用效果显著提高、又不影响其酶学性质的CBD序列，即：野生型纤维素酶StceI的第208-295位氨基酸序列替换为特异腐质霉(Humicolainsolens)来源的纤维素酶的CBD序列。所述特异腐质霉(Humicolainsolens)来源的纤维素酶的CBD序列为SEQIDNO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQIDNO：4。申请人将上述置换了CBD序列的纤维素酶突变体命名为SD，其氨基酸序列为SEQIDNO：5，编码核苷酸序列为SEQIDNO：6。申请人以野生型纤维素酶StceI基因SEQIDNO:2为模板，设计引物StceI-F(含KpnI酶切位点)及R1，PCR扩增得到上游片段；StceI-F：CGGGGTACCGCCGATGGCAAGTCGACC(KpnI)R1:GGGGATCTGGACGGCAGGGAAGTTGCCGTCGTCG以特异腐质霉(Humicolainsolens)来源的纤维素酶的CBD基因SEQIDNO：4为模板，设计引物F1及CBD-R(含MluI酶切位点)，PCR扩增得到下游片段；F1:CGACGACGGCAACTTCCCTGCCGTCCAGATCCCCCBD-R:CGACGCGTCTACAGGCACTGATGATACCAG(MluI)分别以扩增得到的上游片段和下游片段为模板，以StceI-F及CBD-R为引物，进行融合PCR扩增，获得的基因片段即为纤维素酶突变体SD的基因SEQIDNO：6。野生型纤维素酶StceI的基因片段由上海生工生物工程股份有限公司完成，其核苷酸序列为SEQIDNO:2。实施例2纤维素酶突变体的表达2.1表达载体的构建将合成后的纤维素酶突变体基因片段和pSC1G载体分别用限制性内切酶KpnI和MluI(Fermentas)进行酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接并转化大肠杆菌Trans5α(Transgen)，用氨苄青霉素进行选择，并对克隆进行测序(Invitrogen本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纤维素酶突变体，其特征在于，所述的纤维素酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的纤维素酶第208‑295位氨基酸序列替换成特异腐质霉(Humicola insolens)来源的纤维素酶的CBD(Cellulose Binding Domain，纤维素结合域)序列。

【技术特征摘要】
1.一种纤维素酶突变体，其特征在于，所述的纤维素酶突变体是氨基酸序列为SEQIDNO：1的纤维素酶第208-295位氨基酸序列替换成特异腐质霉(Humicolainsolens)来源的纤维素酶的CBD(CelluloseBindingDomain，纤维素结合域)序列。2.如权利要求1所述的纤维素酶突变体，其特征在于，所述的特异腐质霉(Humicolainsolens)来源的纤维素酶的CBD序列，其氨基酸序列为SEQIDNO：3。3.如权利要求1所述的纤维素酶突变体，其特征在于，所述的纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO：5。...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳萍，张青，许丽红，吴佳鹏，黄亦钧，王华明，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37