核酸序列、载体以及提高青蒿中青蒿素含量的方法技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体而言，涉及核酸序列、载体以及提高青蒿中青蒿素含量的方法。一种核酸序列，依次由青蒿中的启动子pCYP和青蒿中的CRY1基因连接而成。该序列能有效促进青蒿中青蒿素的合成，提高青蒿素的含量。本发明专利技术还提供了含有所述的核酸序列的载体，为核酸序列的转入提供良好的基础。本发明专利技术还提供了提高青蒿中青蒿素含量的方法，将上述的核酸序列或者上述的载体转入青蒿中，PCR检测外源目的基因的整合情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定转基因青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。

【技术实现步骤摘要】
核酸序列、载体以及提高青蒿中青蒿素含量的方法
本专利技术涉及基因工程领域，具体而言，涉及核酸序列、载体以及提高青蒿中青蒿素含量的方法。
技术介绍
青蒿(ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿属的一年生草本植物。其次生代谢产物中的青蒿素是重要的抗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。同时，青蒿精油中还富含大量功能各异的单萜和倍半萜，例如1,8-桉叶醇，石竹烯，青蒿酮等等。目前，青蒿素联合疗法(ACTs)是世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法。随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗肿瘤、抗癌以及免疫调节的功能。然而青蒿素在植物青蒿中的含量非常低，大规模商业化生产受到了限制，无法完全满足全球的市场需求。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。通过酵母工程生产青蒿素，前期投入成本大，且产量有限不能满足需求。现有技术表明植物基因工程为提高青蒿中青蒿素的含量提供了一个可行的方法。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种核酸序列，该序列能有效促进青蒿中青蒿素的合成，提高青蒿中青蒿素的含量。本专利技术的第二目的在于提供含有所述的核酸序列的载体，为核酸序列的转入提供良好的基础。本专利技术的第三目的在于提供一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，通过转入目标核酸序列，筛选获得携带该核酸序列的转基因青蒿植株，该植株中的青蒿素含量提高，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种核酸序列，依次由青蒿中的启动子pCYP和青蒿中的CRY1基因连接而成。光作为植物光合作用的能量来源，是调节植物发育和形态发生的最重要的环境因子。光可以调节植物中的基因表达和代谢。研究表明，青蒿在光、盐胁迫和重金属等非生物因素条件下青蒿素产量显著提高。光照影响萜类合成，光处理后的拟南芥可以积累更多的倍半萜。光可以调节青蒿素代谢途径关键酶基因ADS和CYP71AV1的基因表达量。植物通过光敏色素(吸收600-750nm红/远红光)、隐花色素(吸收320-500nm蓝光)、UV-B感光细胞(吸收280～320nm)等光受体响应不同的光质、光强和光周期，其中隐花色素介导多种光诱导的反应。经试验发现，在青蒿中过表达拟南芥隐花色素CRY1基因能提高青蒿素含量。在此基础上，本专利技术人克隆青蒿隐花色素CRY1基因，并与青蒿中的启动子pCYP连接，转化青蒿，探究蓝光受体对青蒿素途径的代谢调控，筛选得到的阳性株为青蒿素高产的青蒿植株，这为规模化生产青蒿素提供一条新途径。进一步地，所述启动子pCYP的DNA序列如SEQIDNO.1所示，所述CRY1基因的DNA序列如SEQIDNO.2所示。进一步地，所述CRY1基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.12所示。进一步地，所述启动子pCYP的DNA序列通过以下方法制备：青蒿的总RNA反转录为cDNA，然后以上游引物如SEQIDNO.3所示和下游引物如SEQIDNO.4所示进行PCR扩增，得到所述启动子pCYP的DNA序列；所述CRY1基因的DNA序列通过以下方法制备：青蒿的总RNA反转录为cDNA，然后以上游引物如SEQIDNO.5所示和下游引物如SEQIDNO.6所示进行PCR扩增，得到所述CRY1基因的DNA序列。本专利技术还提供了含有所述核酸序列的载体。所述载体通过以下方法制备：所述启动子pCYP的DNA序列通过连接酶连接到克隆载体上，然后引入酶切位点进行PCR扩增，得到的产物进行酶切，表达载体进行相应的酶切，产物连接，得到第一载体；所述CRY1基因的DNA序列通过连接酶连接到克隆载体上，然后引入酶切位点进行PCR扩增，得到的产物进行酶切，所述第一载体进行相应的酶切，产物连接，即得所述载体；其中，所述启动子pCYP和所述CRY1基因引入的酶切位点在两者相接的部分相同，其余的不同，并且都在所述表达载体的多克隆位点存在。作为优选，所述表达载体为pCAMBIA2300；所述克隆载体为pLB载体。作为优选，所述启动子pCYP的DNA序列引入的酶切位点为BamHⅠ和SacⅠ；所述CRY1基因的DNA序列引入的酶切位点为HindⅢ和BamHⅠ。进一步地，所述启动子pCYP的DNA序列引入酶切位点进行的PCR扩增所用的上下游引物如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；所述CRY1基因的DNA序列引入酶切位点进行的PCR扩增所用的上下游引物如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示。本专利技术还提供了一种高青蒿中青蒿素含量的方法，包括以下步骤：将上述的核酸序列或者上述的载体转入青蒿中，筛选携带有上述核酸序列的青蒿；该青蒿种植，经提取得到青蒿素。进一步地，所述核酸序列转入青蒿的方法包括电穿孔法、显微注射和基因枪；所述载体通过根癌农杆菌介导的转基因方法转入青蒿中。进一步地，转入的青蒿为嫩苗的叶片。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术提供一种核酸序列，该序列能有效促进青蒿中青蒿素的合成，提高青蒿中青蒿素的含量。(2)本专利技术提供的含有所述的核酸序列的载体，为核酸序列的转入提供良好的基础。(3)本专利技术提供的一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，通过转入目标核酸序列，筛选筛选获得携带该核酸序列的转基因青蒿植株，该植株中的青蒿素含量提高，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为携带有转pCYP-CRY1基因的青蒿与非转化普通青蒿的青蒿素含量检测结果柱形图。具体实施方式本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种转pCYP-CRY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本专利技术涉及的基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、青蒿素提取及含量测定用于本专利技术，建立了稳定提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用青蒿大规模生产青蒿素奠定了基础。整体来说，本专利技术提供的是一种转pCYP-CRY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括以下步骤：(1)采用基因克隆方法获得CYP基因的启动子pCYP；(2)采用基因克隆方法获得CRY1基因；(3)所述pCYP和CRY1基因连接于表达调控序列，构建含pCYP-CRY1基因的植物表达载体；(4)将所述含pCYP-CRY1基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得含所述pCYP-CRY1基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株，然后转化青蒿；(5)筛选获得携带外源目的基因pCYP-CRY1的转基因青蒿植株。步骤(1)中，pCYP基因的DNA序列如SEQIDNO.1所示，所述pCYP基因的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示。pCYP基因通过以下方法制备：提取青蒿基因组总RNA，将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL反转录获得第一链cDNA，根据SEQIDNO.1所示的DNA序列，设计扩增出启动子的上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQIDNO.3所示的DNA序列，所述下游引物为SEQIDNO.4所示的DNA序列，以所述的第一链cDNA为模板，以所述上游引物和所述下游引物为引物对，经PCR扩增后连接到PLB载体上获得中间载体PLB-pCYP进行测序。步骤(2)中，CRY1基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸序列，其特征在于，依次由青蒿中的启动子pCYP和青蒿中的CRY1基因连接而成。

【技术特征摘要】
1.一种核酸序列，其特征在于，依次由青蒿中的启动子pCYP和青蒿中的CRY1基因连接而成。2.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述启动子pCYP的DNA序列如SEQIDNO.1所示，所述CRY1基因的DNA序列如SEQIDNO.2所示，进一步地，所述CRY1基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.12所示。3.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述启动子pCYP的DNA序列通过以下方法制备：青蒿的总RNA反转录为cDNA，然后以上游引物如SEQIDNO.3所示和下游引物如SEQIDNO.4所示进行PCR扩增，得到所述启动子pCYP的DNA序列；所述CRY1基因的DNA序列通过以下方法制备：青蒿的总RNA反转录为cDNA，然后以上游引物如SEQIDNO.5所示和下游引物如SEQIDNO.6所示进行PCR扩增，得到所述CRY1基因的DNA序列。4.含有权利要求1-3任一项所述的核酸序列的载体。5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体通过以下方法制备：所述启动子pCYP的DNA序列通过连接酶连接到克隆载体上，然后引入酶切位点进行PCR扩增，得到的产物进行酶切，表达载体进行相应的酶切，产物连接，得到第一载体；所述CRY1基因的DNA序列通过连接酶连接到克隆载体上，然后引入酶切位点进行PCR扩增，得到的产物进...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵静雅，李杉，张婷婷，马嘉伟，付雪晴，黎凌，孙小芬，唐克轩，张雷，
申请(专利权)人：上海交通大学，广州奈米微晶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31