本发明专利技术涉及一个参与植株形态建成和花发育的白桦SPL2基因及其编码蛋白，属于分子生物学中的基因技术领域。相关基因BpSPL2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术提供白桦BpSPL2基因及其植物表达载体，利用农杆菌介导法在拟南芥中过表达该基因，获得的转基因拟南芥纯合株系出现了花瓣不开展，雌蕊雄蕊均萎蔫皱缩的表型，另有部分转基因株系表现为矮化，初级茎数量或主茎上的侧枝数量增多。表明BpSPL2基因能够影响拟南芥花发育、植株形态建成。本发明专利技术为利用转基因技术调控林木花败育和植株形态建成提供了基因资源和理论依据。
【技术实现步骤摘要】
参与植株形态建成和花发育的白桦SPL2基因及其蛋白
：本专利技术涉及一个参与植株形态建成和花发育的白桦SPL2基因及其蛋白,属于分子生物学中的基因
技术介绍
：SPL(SQUAMOSApromoter-bindingprotein-like)是植物特有的一类转录因子，广泛存在于绿色植物中，最初从金鱼草花序cDNA文库中筛选到2个SPL基因，分别命名为SBP1和SBP2，因其能够识别并结合到SQUAMOSA的启动子上而得名。SPL蛋白构成了一个多样化的转录因子家族，均具有含76个氨基酸的高度保守区段，以此同下游靶基因启动子区域结合,调控靶基因的表达，被命名为SBP结构域。SBP结构域包含一个新的锌指结构和一个核定位信号，参与转录因子进入细胞核，并与含有GTAC的核心基序及其两侧DNA区域特异性结合。不同的SPL基因在不同植物中的功能既有相似之处又各有特点。研究表明水稻OsPL16可以控制米粒大小、形态和色泽，提高OsPL16的表达会促成胚乳细胞增殖及籽粒的充实，并加大粒宽、粒重和水稻产量。拟南芥中，AtSPL2，AtSPL10和AtSPL11在生殖阶段共同调控侧生器官的发育，而且参与调控茎生叶和花的形态建成。AtSPL3，AtSPL4和AtSPL5在控制开花转型上具有类似功能，最近研究表明这三个基因通过SOC1-SPL模型调节光周期和赤霉素信号来控制植物开花。AtSPL9和AtSPL15冗余地调控拟南芥幼年向成年的转型以及叶的形成。SBP基因的研究迄今多数是在草本植物和作物之中，如上述拟南芥、金鱼草、水稻等，而对其在多年生木本植物中的功能研究极少。目前，对于具有较长幼龄期的白桦的SPL基因的功能尚不清楚，也没有涉及白桦SPL2基因序列及其功能的相关专利报道。另外，在拟南芥中，大多数SPL基因功能已被鉴定，而G1区的AtSPL基因功能鲜有报道。本研究利用反向遗传学的手段，通过构建同在G1区的BpSPL2基因的过表达载体，利用农杆菌侵染法对拟南芥进行遗传转化，筛选出转基因株系后对其表型、性状进行分析统计，以此来研究白桦BpSPL2基因功能，同时也是对G1区SPL基因功能的一个补充。
技术实现思路
：本专利技术提供一种从白桦中克隆白桦花发育相关基因BpSPL2的方法：(1)先采用改良的CTAB法提取白桦雄花RNA，用ThermoScriptTMRT-PCRSystem反转录试剂盒，合成cDNA第一链；(2)设计含有CACC位点，克隆白桦BpSPL2编码区全长的PCR引物；引物序列为：正向引物：BpSPL2-F：5′-CACCATGGAGTCTTGGAGTTGCAGTTCAG-3′；反向引物：BpSPL2-R：5′-CACACCTTGTTGGTTGCACACTGC-3′(3)利用引物BPSPL2-F和BPSPL2-R对合成的cDNA进行PCR扩增，获得一个BpSPL2转录因子基因的全长cDNA，命名为白桦BPSPL2；PCR扩增产物经测序，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示；其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示；本专利技术构建了白桦BPSPL2基因的植物表达载体，构建的植物表达载体(pGWB5-BPSPL2)经农杆菌浸染拟南芥植株，获得转基因拟南芥植株；部分转基因纯系植株表现为花停止生长，花瓣不开展，雌蕊雄蕊均萎蔫皱缩。果实败育，角果中种子数量较野生型减少。表明该基因能够影响拟南芥花发育和种子结实率；另外，大部分转基因纯系株系出现了矮化的表型，另有部分转基因植株的初级茎数量或主茎上的侧枝数量增多，表明该基因可能参与植株形态建成，影响主茎高度，侧枝萌蘖。构建白桦BpSPL2基因植物表达载体的技术方案如下：选择pGWB5载体作为基本植物表达载体，首先设计含有CACC位点的白桦BpSPL2全长引物，并克隆出白桦BpSPL2基因全长，将其连接到入门载体pENTRTM/SD/D-利用Gateway技术将该基因连接至植物表达载体pGWB5上。检测构建的载体pGWB5-BpSPL2。本专利技术提供的白桦BpSPL2基因在调节拟南芥花发育，降低花的育性和种子结实率的应用。将上述植物表达载体pGWB5-BpSPL2转化农杆菌EHA105，经农杆菌介导的浸花法浸染，获得白桦BpSPL2过表达的转基因拟南芥植株，经抗性筛选及PCR检测最终得到12个转基因阳性纯合株系：line1-line12；白桦BpSPL2可以降低转基因拟南芥的育性，转基因纯合株系的花不育率大于野生型非转基因植株，部分转基因株系花的不育率高达60％以上；转基因纯合株系的种子结实率低于野生型非转基因植株。另外，部分转基因纯系株系出现了矮化、初级茎数量、主茎上的侧枝数量增多的表型，表明该基因可能参与植株形态建成，影响主茎高度，侧枝萌蘖。本专利技术为今后利用转基因技术对林木开花进行调控，培育不育的林木提供了基因资源，同时为利用基因工程技术调控植株形态建成提供理论依据，具有很大的应用价值。本专利技术与现有的技术相比具有如下有益效果：1、本专利技术提供了调控植物花发育的BpSPL2蛋白，可用于调控林木开花，培育不育的林木，并且可用于搜寻在其他植物中与花发育相关的基因。2、本专利技术提供的含有白桦BpSPL2基因重组载体，可有效负调控植物花发育和种子结实率，对植株的形态建成也具有调节作用。3、本专利技术提供的BpSPL2基因具有调控花育性、种子结实率、参与植株形态建成的功能，可用于林木植物花发育研究中，并为植物SBP基因家族功能研究提供参考资源。附图说明图1为白桦BPSPL2基因全长cDNA的PCR扩增显示图。图2为植物表达载体pGWB5图谱。图3为植物表达载体pGWB5-BPSPL2PCR检测图。图4为转基因过表达白桦BPSPL2拟南芥植株PCR验证图，1-12为转基因株系，13，14为pGWB5-BPSPL2质粒阳性对照。图5为转基因过表达白桦BPSPL2拟南芥株系Line6。图6为转基因过表达白桦BPSPL2拟南芥株系Line1。图7为转基因过表达白桦BPSPL2拟南芥株系败育花表型。图8为转基因过表达白桦BPSPL2拟南芥株系不育的角果表型。图9为转基因过表达白桦BPSPL2拟南芥株系败育花的解剖结构。具体实施方式：下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：白桦BpSPL2基因的克隆(1)植物材料的获得实验材料白桦雄花，采自东北林业大学白桦林。采集后立即冷藏到-80℃冰箱保存备用。(2)白桦RNA的抽提白桦总RNA使用改良的CTAB法步骤进行，使用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计测总RNA的纯度和浓度。用ThermoScriptTMRT-PCRSystem反转录试剂盒合成cDNA第一链，然后用BpSPL2-F和BpSPL2-R进行PCR扩增，PCR反应体系：cDNA模板1μL，10×Buffer5μL，dNTP(2.5mM)4μL，正反向引物各2μL(10μM)，TaqPlusDNApolymerase1μL，灭菌蒸馏水补足50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃延伸10min。PC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个参与植株形态建成和花发育的白桦SPL2基因及其蛋白，其特征在于降低花的育性和种子结实率，参与植株形态建成，影响侧枝萌蘖。BpSPL2基因的序列如序列表SEQ ID NO:1所示；其编码的蛋白的氨基酸序列如列表SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一个参与植株形态建成和花发育的白桦SPL2基因及其蛋白，其特征在于降低花的育性和种子结实率，参与植株形态建成，影响...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘雪梅，胡晓晴，张淇，王晟宇，张正一，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23
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