一种无创高通量甲基化前列腺癌诊断、研究和治疗方法技术

无创高通量甲基化前列腺癌诊断、研究和治疗方法，其特征在于基于大通量平行甲基化检测组合测序并加血液中的cfRNA信息，鉴定与前列腺癌症相关的基因中甲基化的变化：检测样品基因中DNA甲基化的存在与否，以产生甲基化谱，建立SOBP，SUCLG2，SHOX2，ZDHHC1基因含有的特异性CpG岛位点，用特异性的抗甲基胞嘧啶抗体识别并结合到发生甲基化的DNA片段，利用免疫沉淀技术建立甲基化二代测序文库和靶标位点富集；并将甲基化谱与标准谱比较,对甲基化位点测序生物信息利用“瀑布”机理分析是否有癌症,再结合cfRNA的基因信息和甲基化位点的计算综合分析，能够早期发现人体内前列腺器官或部位的肿瘤。

A method of diagnosis, study and treatment of noninvasive high throughput methylation of prostate cancer

Noninvasive diagnosis, high-throughput methylation of prostate cancer research and treatment, which is characterized in that the flux parallel detection of methylation sequencing and combination of cfRNA in the blood of information based on the identification of gene methylation changes associated with prostate cancer: detection of DNA methylation exists in sample genes or to produce methyl of the spectrum, the establishment of SOBP, SUCLG2, SHOX2, specific CpG island sites containing the ZDHHC1 gene, with anti methylcytocine antibody recognition specificity and binding to methylated DNA fragments, the establishment of the two generation technology of methyl precipitation and enrichment by sequencing library target sites of immune; and methylation spectrum compared with the standard and for methylation sequencing biological information using the \waterfall\ mechanism analysis of whether there is a cancer, combined with a comprehensive analysis of the information and computing cfRNA gene methylation sites, early A tumor of the body or part of the prostate is found in the body.

【技术实现步骤摘要】
一种无创高通量甲基化前列腺癌诊断、研究和治疗方法
本专利技术涉及生物技术基因甲基化检测，具体是一种无创高通量甲基化前列腺癌诊断、研究和治疗方法。
技术介绍
近年来,表观遗传学研究已经成为癌症研究的一个新方向。1983年,科学家们首次发现DNA甲基化与癌症之间存在着密切的关系。基因组DNA上各CpG位点甲基化状态的差异构成基因组DNA甲基化谱，基因组DNA异常甲基化会导致人类多种疾病的发生和发展。大量研究结果显示,表观遗传修饰的异常改变与癌症有着十分密切的联系,全基因组范围内的表观遗传修饰改变已经成为癌症的新标记。最新的观点认为,癌症的发生发展不仅仅与遗传改变相关,表观遗传修饰的异常改变也贯穿于癌症的各个阶段。因此,这就意味着癌症在一定程度上是一种表观遗传疾病。DNA甲基化作为表观遗传修饰的重要组成部分,其在癌症的早期诊断、治疗、预后以及预防等方面的研究也取得了相应的成果。世界卫生组织指出，三分之一的癌症可以预防，三分之一的癌症可以治疗，要想预防和治疗，就必须要早期诊断，早期诊断、早期治疗不但可以节省大量花费，更重要的的是大大提高病人的生存率。现在多数肿瘤检测是针对基因突变或者重组的，对用药有指导意义(比较简单)但不能检测早期肿瘤。直到目前为止技术上的限制，科学家和实验室里还只能对单一类肿瘤进行早期筛查，实现这种高灵敏度高准确的一次检测早期诊断所有肿瘤的技术，目前还有许多技术难点。尤其目标甲基化位点的富集，现在市场上没有甲基化下一代测序的完整解决方案。对于具有临床意义的甲基化位点的解读需要通过大量临床研究获得，这些位点对于检测的准确性至关重要。目前还没有成熟的方法和可靠的数据解读这些测序资料。有两个问题涵待解决，一是测序后得到大量信息如何分析，二是分析得出结果，与临床是否符合，与病情是否符合。总之，虽然DNA甲基化检测是公认的早期癌症检测方法，但是因为目前技术在灵敏度和准确性上都达不到临床使用的地步。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种无创高通量甲基化前列腺癌诊断、研究和治疗方法，基于高通量基因甲基化的下一代测序技术，鉴定与前列腺癌症相关的基因中甲基化模式的变化，能够早期发现人体内前列腺器官或部位的肿瘤。一种无创高通量甲基化前列腺癌诊断、研究和治疗方法，包括但不限于癌症标志物，提供来自受试者的生物样品及包含的基因组DNA，其特征在于基于大通量平行甲基化检测组合测序M-NGS同时加上血液中的cfRNA信息，鉴定与前列腺癌症相关的基因中甲基化的变化：检测受试者的生物样品一个或多个基因中DNA甲基化的存在与否，以产生受试者的甲基化谱，包括建立SOBP，SUCLG2，SHOX2，ZDHHC1基因含有的特异性CpG岛位点，使用特异性的抗甲基胞嘧啶抗体识别并结合到发生甲基化的DNA片段，利用免疫沉淀技术达到富集的效果，来实现甲基化二代测序文库的建立和靶标位点的富集；并将受试者的甲基化谱与一个或多个标准甲基化谱进行比较,对甲基化位点测序生物信息利用“瀑布”机理计算综合分析得出受试者是否有癌症的结论,结合来自无细胞核糖核酸cfRNA的基因信息确定癌症的发生以及定位。本专利技术突出贡献：本专利技术发展了基于基因甲基化的下一代测序技术的应用，通过靶标位点的富集建立下一代测序文库,得到的甲基化谱结合cfRNA提供的基因信息，能够早期发现人体内任何器官或部位的肿瘤。现在美国做早期肿瘤血检的只有比尔盖兹投资的GRAIL，但是本专利技术方法与他们不完全一样，另外，GRAIL也没有同时检测cfRNA，不知道基因表达情况，因此其结论与临床准确性符合程度受到影响。并且他们的数据库建立因为病人数量不充足的影响，基础样本数目规模也会受到限制，因此与比尔盖兹投资的GRAIL的竞争对手可以忽略不计。本专利技术的技术是基于大通量平行甲基化检测组合测序，在本行业里处于领先地位，同时加上cfRNA信息分析方法。众所周知，基因的开关必须由RNA来判断，DNA甲基化只是上游信息，只有把这两个方面信息结合起来，敏感度和准确度才能都达到非常好的程度。首先我们对甲基化位点测序生物信息利用“瀑布”机理分析得出结论，得到特异的CpG岛位点，然后对所有甲基化的有效位点都通过临床标本和正常标本的对比,根据这些位点的检测和分析，在前列腺癌上已经有83％的准确率，特别在临床特异性上对于前列腺癌已经达到90％以上。此外，本专利技术创造性的包含了cfRNA信息技术：当只获得基因甲基化的信息后，你不知道该基因的表达情况，本专利技术的cfRNA的信息能准确的知道该基因的表达情况，就可以更清楚的发现基因表达的变化，从而更准确的确定早期发现癌变的部位，对广谱肿瘤诊断如虎添翼。简言之，该基因甲基化技术具有独特性和前瞻性，可以预早期测前列腺肿瘤的发生。目前可见的和可用的所有检测方法都不能完成，市场上还没有专门针对早期肿瘤筛查的基于甲基化的广谱肿瘤下一代测序方案，我们已经找到突破口，并取得了成功。附图说明图1为前列腺组织中DNA甲基化模式显示图；图2为前列腺组织中SOBP，SUCLG2，SHOX2，ZDHHC1的总甲基化％示意图。具体实施方式本专利技术的无创高通量甲基化前列腺癌诊断、研究和治疗方法，包括但不限于癌症标志物，提供来自受试者的生物样品及包含的基因组DNA，其特征在于基于大通量平行甲基化检测组合测序同时加上血液中的cfRNA信息，鉴定与前列腺癌症相关的基因中甲基化模式的检测方法：检测生物样品的一个或多个基因中DNA甲基化的存在与否，以产生受试者的甲基化谱，以及将受试者的甲基化谱与一个或多个标准甲基化谱进行比较。所述标准甲基化谱选自于非癌性样品的甲基化谱和癌性样品的甲基化谱。本专利技术的cfRNA信息技术：利用血液中游离的肿瘤细胞释放的RNA，能够强力抵抗血液中的核糖核酸酶的降解，并且存在足够的水平以便进行定量分析这个特性，并且这些循环的RNA在癌症患者的血清和血浆中与健康人的相比明显上升，通过它们获得的基因信息，结合受试者的甲基化图谱的结果，进而给出确切的诊断结果。本专利技术所述无创高通量甲基化前列腺癌症的诊断方法，提供来自诊断为癌症的受试者的生物样品，包含的基因组DNA，其特征在于把鉴定基因在启动子区域的CGI岛和CpG岛中的甲基化水平作为前列腺癌的诊断标志物和临床靶标；当存在甲基化水平增加时，对应的就是所述基因的表达降低。具体为筛选受试者中前列腺癌存在的方法，包括(a)从来自受试者的生物样品中提取基因组DNA,随后对其进行亚硫酸氢盐转化；和(b)使用体外测定法高通量二代测序仪检测所述基因SOBP，SUCLG2，SHOX2，ZDHHC1的甲基化状态，在所述受试者的受试样品中，上述基因的甲基化程度相对于正常前列腺细胞，指示结果显示甲基化水平升高的是前列腺癌。本专利技术还提供了进一步的一种诊断癌症的方法，癌症的表征包括确定疾病存在或不存在的机会。在更进一步的实施方案中，癌症的表征包括确定发生转移性疾病的风险。在其它实施方案中，癌症的表征还包括监测所述受试者的疾病进展情形。把上述检测方法得到的检测结果，用下面诊断方法算法计算之后，得到癌症的表征风险评价，从而给出受试者的癌症发展的准确结论。本专利技术提供了表征定性前列腺癌症的方法，包括提供来自诊断为癌症的受试者的生物样品及包含的基因组DNA，其特征在于检测基因甲基化是在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无创高通量甲基化前列腺癌诊断、研究和治疗方法，包括但不限于癌症标志物，提供所用组合物来自受试者的生物样品及包含的基因组DNA，其特征在于基于大通量平行甲基化检测组合测序M‑NGS同时加上血液中的cfRNA信息，鉴定与前列腺癌症相关的基因中甲基化的变化：检测受试者的生物样品一个或多个基因中DNA甲基化的存在与否，以产生受试者的甲基化谱，包括建立SOBP，SUCLG2，SHOX2，ZDHHC1基因含有的特异性CpG岛位点，使用特异性的抗甲基胞嘧啶抗体识别并结合到发生甲基化的DNA片段，利用免疫沉淀技术达到富集的效果，来实现甲基化二代测序文库的建立和靶标位点的富集；并将受试者的甲基化谱与一个或多个标准甲基化谱进行比较,对甲基化位点测序生物信息利用“瀑布”机理计算综合分析得出结论受试者是否有癌症,结合来自无细胞核糖核酸cfRNA的基因信息确定癌症的发生并且定位。

【技术特征摘要】
1.一种无创高通量甲基化前列腺癌诊断、研究和治疗方法，包括但不限于癌症标志物，提供所用组合物来自受试者的生物样品及包含的基因组DNA，其特征在于基于大通量平行甲基化检测组合测序M-NGS同时加上血液中的cfRNA信息，鉴定与前列腺癌症相关的基因中甲基化的变化：检测受试者的生物样品一个或多个基因中DNA甲基化的存在与否，以产生受试者的甲基化谱，包括建立SOBP，SUCLG2，SHOX2，ZDHHC1基因含有的特异性CpG岛位点，使用特异性的抗甲基胞嘧啶抗体识别并结合到发生甲基化的DNA片段，利用免疫沉淀技术达到富集的效果，来实现甲基化二代测序文库的建立和靶标位点的富集；并将受试者的甲基化谱与一个或多个标准甲基化谱进行比较,对甲基化位点测序生物信息利用“瀑布”机理计算综合分析得出结论受试者是否有癌症,结合来自无细胞核糖核酸cfRNA的基因信息确定癌症的发生并且定位。2.根据权利要求1所述的无创高通量甲基化前列腺癌诊断、研究和治疗方法，提供来自诊断为癌症的受试者的生物样品，包含的基因组DNA，其特征在于表征定性癌症的诊断方法，检测该基因在启动子区域的CGI岛和CpG岛中的甲基化水平，作为前列腺癌的诊断标志物和临床靶标，当存在甲基化水平增加时，对应的就是所述基因的表达降低；2a.从来自受试者的生物样品中提取基因组DNA,随后对其进行亚硫酸氢盐转化；2b.检测基因甲基化是在基因的5`非翻译区中，使用体外测定法高通量二代测序仪检测所述基因SOBP，SUCLG2，SHOX2，ZDHHC1的甲基化状态，在所述受试者的受试样品中，上述基因的甲基化程度相对于正常前列腺细胞，指示结果显示甲基化水平升高的是前列腺癌。3.一种无创高通量甲基化前列腺癌诊断、研究和治疗方法，提供来自诊断为癌症的受试者的生物样品，其特征在于检测受试者的生物样品基因组DNA甲基化的存在与否，用甲基化敏感性限制酶消化基因组DNA，随后对含有CpG岛的特异性DNA片段进行基因扩增。4.根据权利要求1所述的无创高通量甲基化前列腺癌诊断、研究和治疗方法，其特征在于诊断方法算法：SOBP，SUCLG2，SHOX2，ZDHHC1的DNA甲基化模式的变化将用下式计算：诊断危险因素＝4个基因中的总甲基化CpG岛/4个基因中的总CpG岛诊断方法：如果这个数字小于0.15，患者就没有任何前列腺癌风险；如果这个数字在0.15-0....

【专利技术属性】
技术研发人员：宫明，
申请(专利权)人：沈阳宁沪科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21