葡甘低聚糖酶及其制备方法技术

本发明专利技术属于食品加工领域，具体涉及一种葡甘低聚糖酶及其制备方法。所述的制备方法以解淀粉芽孢杆菌为培养菌株，在发酵培养基中培养。其中，发酵培养基包括下述质量分组分：碳源：葡萄糖10‑60份；氮源：有机氮源，4‑7份，无机氮源，0.5‑4份；所述的有机氮源为酵母粉、尿素者蛋白胨的一种或者几种混合；所述的无机氮源为硫酸铵、氯化铵以及硝酸铵的一种或者几种混合。本发明专利技术中以解淀粉芽孢杆菌为培养菌株，在无葡甘低聚糖作诱导物的情况下可以产生葡甘低聚糖酶，降低了成本，有别于其它产葡甘低聚糖酶菌株，是一种新发现。

【技术实现步骤摘要】
葡甘低聚糖酶及其制备方法
本专利技术属于食品加工领域，具体涉及一种葡甘低聚糖酶及其制备方法。
技术介绍
魔芋(Amurphophalluskonjac)，别名“蒟蒻”，是天南星科魔芋属(AmorphnphallusBlame)单子叶植物纲多年生宿茎草本植物，主要生长在海拔250-2500米的地方。我国的魔芋种植区主要分布在四川、云南、贵州、广西、湖南和湖北等地。魔芋块茎中的主要功能活性成分是魔芋葡甘低聚糖(konjacglucomannan，简称KGM)。魔芋葡甘低聚糖是葡萄糖与甘露糖按1:1.6的摩尔比通过β-1,4糖苷键连接而成的多糖。魔芋葡甘低聚糖属于水溶性高分子多糖，由于其极高的粘度，在食品应用中受到添加量的限制，而将其降解成一定分子量的低聚糖，一可明显降低其粘度，提高产品在加工过程中的可操作性，二可大幅度提升其在食品中的添加量，而不显著影响食品的质构，同时该类低聚糖还具有良好益生元的效果，对改善肠道微生物结构有促进作用。因此专利技术一种操作简单、成本低的生产魔芋葡甘低聚糖的方法以满足市场的要求，具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中没有操作简单，成本的生产魔芋葡甘低聚糖的缺陷，提供一种葡甘低聚糖酶及其制备方法。为实现本专利技术的目的，所采用的技术方案为：一种葡甘低聚糖酶的制备方法，以解淀粉芽孢杆菌为培养菌株，在发酵培养基中培养。所述的发酵培养基包括下述质量分组分：碳源：葡萄糖10-60份；氮源：有机氮源，4-7份，无机氮源，0.5-4份；所述的有机氮源为酵母粉、尿素或者蛋白胨的一种或者几种混合；所述的无机氮源为硫酸铵、氯化铵以及硝酸铵的一种或者几种混合。所述的发酵培养基包括下述质量分组分：葡萄糖40份；酵母粉6份；硫酸铵1.32份；磷酸氢二钾2.0份；硫酸镁0.1份。所述的发酵培养基包括下述质量分组分：葡萄糖40份；酵母粉6份；硫酸铵1.32份；磷酸氢二钾2.0份；硫酸镁0.1份；水1000份，pH值为7.0；培养条件为：转速200r/min，培养温度为30℃，培养时间为3-4d。本专利技术还包括一种所述的制备方法得到的葡甘低聚糖酶。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术中以解淀粉芽孢杆菌为培养菌株，在无葡甘低聚糖作诱导物的情况下可以产生葡甘低聚糖酶，降低了成本，有别于其它产葡甘低聚糖酶菌株，是一种新发现。同时通过优化发酵培养基成分，得到一种高产葡甘低聚糖酶的解淀粉芽孢杆菌，优化后的发酵培养基所产葡甘低聚糖酶酶活性高。附图说明图1示出碳源的选择的酶活性曲线；图2示出葡萄糖添加量的选择的酶活性曲线；图3示出氮源的选择的酶活性曲线；图4示出酵母粉添加量的选择的酶活性曲线；图5示出硫酸铵添加量的选择的酶活性曲线；具体实施方式为了使本
的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，结合附图和实施例对本专利技术进行叙述说明。一、菌种的筛选：1、制备土壤稀释液：从农田土壤中采集土样，将采集到的样品放入无菌水中，充分混匀使微生物细胞分散，静置使澄清。吸取上清液加入无菌水中，用无菌水稀释成10：1、10：2、10：3、10：4等不等浓度梯度。2、培养：各稀释浓度加入冷却至55℃左右的灭菌的YM固体培养基(葡萄糖10g，酵母粉3g，麦芽汁提取物3g，胰蛋白胨5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.0)，制成平板。倒置恒温培养箱内37℃培养至长出菌落。3、挑取单菌落及纯化：待平板上长出菌落后，根据形态和粘性选取单菌落于平板划线纯培养，重复此方法3-5次至所分离到的菌株为单菌落。该培养物在固体培养基上呈白色，菌落形状不规则，表面有褶皱，用接种环挑取时感觉粘稠。4、初筛与复筛种子培养：将筛选菌株接种于YM液体种子培养基(葡萄糖10g，酵母粉3g，麦芽汁提取物3g，胰蛋白胨5g，蒸馏水1000mL，pH7.0)中，装液量为100mL/500mL三角瓶，于200r/min、30℃摇床培养1d。发酵培养：取10mL种子液转接于发酵培养基(蔗糖20g，酵母粉5g，NH4NO30.8g，K2HPO42g，MgSO40.1g，pH7.0)中，装液量为100mL/500mL三角瓶，200r/min，30℃摇床培养4d，测定发酵液的酶活力。选取一株具有高酶活发酵液分泌菌作为目标菌株。5、菌种的鉴定利用16SrDNA序列比对法对筛选到的菌株进行分子生物学鉴定，结果表明该菌株与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)亲缘关系最近，相似度为99％。二.解淀粉芽孢杆菌产葡甘低聚糖酶粗酶液的制备1.菌种活化：将冻干保藏的解淀粉芽孢杆菌菌种在37℃培养箱里活化30分钟。2.接种：用接种环挑取一环活化好的菌种，“之”型接到斜面培养基上，37℃条件下培养24小时。斜面培养基的配制：称取蛋白胨10g，牛肉膏30g，氯化钠5g，琼脂20g，放入1000mL水中，加热、充分混匀后将pH调整到7.2-7.4，121℃湿热灭菌20分钟。适当冷却后装到提前灭完菌的试管中，装量为试管的1/3，塞好试管口，侧倒使其呈斜面，冷却凝固后备用。3.种子液的制备：取一管斜面培养的菌种，用接种环移入250mL三角瓶装的90mL种子培养液中，在200r/min，30℃条件下振荡培养24小时。种子培养液的配制：称取无水葡萄糖10g，酵母粉3g，麦芽汁提取物3g，胰蛋白胨5g，放入1000mL水中，充分混匀，分装到250mL三角瓶中，装液量为90mL，用塞子塞好三角瓶口，121℃湿热灭菌20分钟，冷却后备用。4.发酵液的制备：将上述种子液以10％接种量接种到装液量为90mL/250mL的发酵培养液中，在200r/min、30℃条件下振荡培养3-4天。发酵培养液的配制：称取葡萄糖40g；酵母粉6g，硝酸铵1.32g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.1g，放入1000mL水中，充分混匀后将pH调整到7.0，分装到250mL三角瓶中，装液量为90mL，用塞子塞好三角瓶口，121℃湿热灭菌20分钟，冷却后备用。5.粗酶液的制备：将上述发酵液经10000r/min、4℃离心25min，所得上清液即为粗酶液。三：葡甘低聚糖酶酶活力的测定25mL具塞试管中加入0.9mL0.5％(W/V)魔芋粉底物(PH6.5，0.05M磷酸缓冲溶液配制)，50℃预热2min；加入0.1mL适当稀释的葡甘低聚糖酶酶液，50℃反应10min；立即加入DNS试剂3mL终止反应，沸水浴5min，流水冷却并用蒸馏水定容至25mL，于波长540nm处测定吸光度值，以灭活酶液做空白对照，根据酶活公式计算酶活。酶活定义：在上述反应条件下，底物每分钟释放1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位，以U/mL表示。实施2-4:实施例2-4与实施例1的制备方法相同，区别仅在于，发酵培养液中的碳源的选择不同，分别选用20g/L的不同碳源(实施例2为蔗糖、实施例3为葡萄糖、实施例4为85％麦芽糖浆)，将种子液以10％接种量，接种到发酵培养液中，在200r/min、30℃条件下振荡培养4天测定酶活，每次做3组平行实验，下同。结果如图1所示，本专利技术获得的解淀粉芽孢杆菌产酶最适碳源为葡萄糖，此时酶活可达339.36U/mL。实施例5-10:实施例5-10与实施例1的制备方法相同，发酵培养液中以葡萄糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡甘低聚糖酶的制备方法，其特征在于，以解淀粉芽孢杆菌为培养菌株，在发酵培养基中培养。

【技术特征摘要】
1.一种葡甘低聚糖酶的制备方法，其特征在于，以解淀粉芽孢杆菌为培养菌株，在发酵培养基中培养。2.根据权利要求1所述的葡甘低聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括下述质量分组分：碳源：葡萄糖10-60份；氮源：有机氮源，4-7份，无机氮源，0.5-4份；所述的有机氮源为酵母粉、尿素者蛋白胨的一种或者几种混合；所述的无机氮源为硫酸铵、氯化铵以及硝酸铵的一种或者几种混合。3.根据权利要求1所述的葡甘低聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述的发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：周中凯，吴丹丹，商文婷，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12