用于测量样品中的血清素的方法和系统技术方案

本发明专利技术公开了利用液相色谱法和质谱法测量样品中的血清素的方法和系统。

Methods and systems for the measurement of serotonin in samples

The invention discloses a method and system for measuring serotonin in a sample by liquid chromatography and mass spectrometry.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测量样品中的血清素的方法和系统相关申请的交叉引用本申请要求于2015年3月3日提交的美国临时专利申请No.62/127,590的权益，以引用的方式将该专利申请全文并入本文。专利
本专利技术涉及通过测量样品中的血清素间接测量肝素诱导的自身抗体的方法和系统。在某些实施方案中，本专利技术提供了采用液相色谱法和质谱法来测量从供体血小板释放的血清素或稳定标记血清素的方法和系统，该供体血小板用来自疑似患有肝素诱导性血小板减少症(HIT)的患者的标本进行了攻击(challenged)。
技术介绍
肝素诱导性血小板减少症(HIT)是一种潜在灾难性的、抗体介导的肝素疗法并发症，其由针对与肝素或其他多聚阴离子复合的血小板因子4(PF4)的免疫所引起。HIT抗体结合至血小板表面上的PF4/肝素复合物，从而导致血小板激活，该激活导致血小板计数降低，这可伴随危及生命的血栓。这种促凝血障碍可产生灾难性的血栓栓塞性并发症，包括缺血性肢体坏死、肺栓塞、心肌梗塞和中风。中度血小板减少症在其中施用肝素的临床环境中常见并且大多数病例不是由HIT引起。将HIT与血小板减少症的其他潜在原因相区分在评价肝素化的血小板减少症患者时是一个很难的诊断方面，并且依赖于临床评价和实验室调查的联合。快速诊断和管理对最大可能地减小危及生命的血栓风险至关重要。诊断有或者疑似患有HIT的患者必须尽可能快地除去肝素并转换为备选的非肝素抗凝剂。HIT的实验室调查具有挑战性，需要将临床症状和实验室测定相结合。所进行的最常用测定法是血清学测定法，该测定法检测HIT抗体的存在而不考虑它们的功能能力。相对易于执行的数种血清学测定法可商购获得，并且这些测定法是高度灵敏的。这些测定法的结果具有极佳的阴性预测价值，阴性结果可用于在除了最难的临床情况外几乎所有的情形中排除HIT。然而，这些测定法的缺点是特异性低，常常在不存在临床HIT时给出阳性结果。阳性结果，尤其是低滴度的阳性结果，不能区分致病抗体与临床不相关的抗体。测量HIT的另一种方法是使用可测量血小板功能的测定法，即功能测定法。测量HIT抗体在存在肝素的情况下激活血小板的功能测定法被视为金标准诊断性实验室测试，这是由于其能够在患有真正HIT的患者中检测患者潜在的前凝血状态。一种功能测定法是测量血小板释放的血清素，即血清素释放测定法(SRA)。在该测定法中，来自肝素诱导性血小板减少症(HIT)患者的血清在治疗浓度的肝素下引发血小板凝集和分泌，但在高浓度肝素下不引发。一般而言，这种测定法测量从血小板释放的放射标记血清素。然而，由于操作复杂，利用经洗涤的血小板的功能测定法并不广泛普及。此外，利用经洗涤的血小板的血清素释放测定法通常利用已与放射标记血清素一起温育的血小板来进行，从而伴有与采用放射性物质相关的缺点。
技术实现思路
本文描述了通过测量样品中的血清素而间接测量肝素诱导的抗体的方法和系统。在某些实施方案中，本专利技术提供了采用液相色谱法和质谱法来测量从供体血小板释放的血清素或稳定标记血清素的方法和系统，该供体血小板用来自疑似患有肝素诱导性血小板减少症(HIT)的患者的标本进行了攻击。本专利技术的方法和系统具有优于其他方法的优点，因为该测定法不需要使用放射标记血清素。此外，该方法结合了LC-MS/MS系统，该系统导致对HIT的测试更灵敏、更准确。该方法可用于与异常供体血小板激活相关的其他病症和疾病。本专利技术可以各种各样的方式来实施。在至少一个方面，本专利技术提供了测定样品中所释放的血清素和/或稳定标记血清素的存在或量的方法，该方法包括：提供样品，所述样品包含生物样品、供体血小板和肝素；将所述样品温育一段时间以从所述供体血小板释放血清素；利用液相色谱法将血清素与所述温育样品中的其他组分色谱上分离；以及通过质谱法分析所述色谱上分离的血清素以测定所述样品中释放的血清素相对于所述供体血小板内可用的血清素总量的存在或量。下面详细描述这些方法的其他实施方案。在另一个方面，本专利技术提供测定样品中所释放的血清素的存在或量的方法，该方法包括：提供样品，所述样品包含生物样品、肝素和经血清素温育的血小板；将所述样品温育一段时间以从所述血小板释放血清素；利用液相色谱法将血清素与所述温育样品中的其他组分色谱上分离；以及通过质谱法分析所述色谱上分离的血清素以测定所述组合样品中释放的血清素相对于所述供体血小板内可用的血清素总量的存在或量。下面详细描述这些方法的其他实施方案。在另一个方面，本专利技术提供测定样品中所释放的稳定的同位素标记血清素的存在或量的方法，该方法包括：提供样品，所述样品包含生物样品、肝素和经稳定的同位素标记血清素温育的血小板；将所述样品温育一段时间以从所述血小板释放稳定的同位素标记血清素；利用液相色谱法将稳定的同位素标记血清素与所述温育样品中的其他组分色谱上分离；以及通过质谱法分析所述色谱上分离的稳定同位素标记血清素以测定所述样品中所释放的稳定同位素标记血清素相对于供所述体血小板内可用的稳定同位素标记血清素总量的存在或量。下面详细描述这些方法的其他实施方案。在另一个方面，本专利技术提供生成可用于诊断与异常供体血小板激活相关的疾病或病症的报告的方法，该方法包括：提供样品，所述样品包含生物样品、供体血小板和肝素；将所述样品温育一段时间以从供体血小板释放血清素或稳定的经标记血清素；利用液相色谱法将血清素与所述温育样品中的其他组分色谱上分离；通过质谱法分析所述色谱上分离的血清素以测定所述样品中所释放的血清素相对于所述供体血小板内可用的血清素总量的量；以及生成列出所述样品中血清素的释放百分比的报告。下面详细描述这些方法的其他实施方案。在另一个方面，本专利技术提供用于测定样品中血清素的存在或量的系统，该系统包括用于提供样品的工位，所述样品包含生物样品、供体血小板和肝素；用于将所述样品温育一段时间以从所述供体血小板释放血清素的工位；用于利用液相色谱法将血清素与所述温育样品中的其他组分色谱上分离的工位；以及用于通过质谱法分析所述色谱上分离的血清素以测定所述样品中所释放的血清素相对于所述供体血小板内可用的血清素总量的存在或量的工位。这些系统的其他实施方案在下面详细描述。本专利技术的另外的方面在下面详细描述。附图说明本申请包括以下附图。这些附图旨在图示本专利技术的某些实施方案和/或特征，以及旨在补充对本专利技术的任何描述。附图不限制本专利技术的范围，除非说明书中明确地指明如此。图1为将从非掺料血小板释放的血清素(常规)、从掺有血清素的血小板释放的血清素(掺有S)和从掺有d4-血清素的血小板释放的血清素(掺有D4-S)的释放百分比相比较的曲线图。虚线表示与供体血小板中可用的总血清素相比较的20％释放率。图2为用于诊断肝素诱导性血小板减少症的血清素释放测定法解读模式的图示。图3示出了得到阳性HIT测结果的本文所述血清素释放测定法的色谱图。左边分图示出了内源性血清素；中间分图示出了0.2U/mL肝素下的血清素释放；右边分图示出了100U/mL肝素下的血清素释放。图4示出了将测定法的定量下限(LLOQ)(左边)与阳性释放样品(右边)相比较的色谱图。具体实施方式下面的描述列出了本专利技术的各个方面和实施方案。没有哪个具体的实施方案是旨在限定本专利技术的范围。相反，这些实施方案仅仅提供至少包括在本专利技术范围内的各种方法和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定样品中释放的血清素的存在或量的方法，所述方法包括：提供样品，所述样品包含生物样品、供体血小板和肝素；将所述样品温育一段时间以从所述供体血小板释放血清素；利用液相色谱法将血清素与所述温育样品中的其他组分在色谱上分离；以及(d)通过质谱法分析所述在色谱上分离的血清素以测定所述样品中释放的血清素的存在或量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.03 US 62/127,5901.一种测定样品中释放的血清素的存在或量的方法，所述方法包括：提供样品，所述样品包含生物样品、供体血小板和肝素；将所述样品温育一段时间以从所述供体血小板释放血清素；利用液相色谱法将血清素与所述温育样品中的其他组分在色谱上分离；以及(d)通过质谱法分析所述在色谱上分离的血清素以测定所述样品中释放的血清素的存在或量。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是血清样品或血浆样品。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品从经肝素处理的受试者获得。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品从疑似患有肝素诱导性血小板减少症的受试者获得。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体血小板从至少一名假定健康的受试者获得。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品中的供体血小板经洗涤和部分纯化。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述温育步骤是在室温下进行。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述温育步骤进行至少30分钟。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述提供步骤中的肝素以0.001至1U/mL的量存在。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述提供步骤中的肝素以50至1000U/mL的量存在。11.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述色谱上分离的步骤之前使所述温育样品与内标接触。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述内标为血清素的稳定的同位素标记形式。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述血清素的稳定的同位素标记形式包含氘标记的血清素、碳-13标记的血清素、氮-15标记的血清素、氧-18标记的血清素或它们的组合。14.根据权利要求11所述的方法，其中所述内标是血清素-d4。15.根据权利要求1所述的方法，其中将所述提供步骤中的供体血小板在所述提供步骤之前与血清素一起温育。16.根据权利要求1所述的方法，其中将所述提供步骤中的供体血小板在所述提供步骤之前与氘标记的血清素、碳-13标记的血清素、氮-15标记的血清素、氧-18标记的血清素或它们的组合一起温育。17.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述色谱上分离的步骤之前部分纯化所述温育样品。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述部分纯化步骤包括离心所述温育样品。19.根据权利要求1所述的方法，其中使用液相色谱法包括使用分析液相色谱法。20.根据权利要求19所述的方法，其中使用分析液相色谱法包括使用反相柱。21.根据权利要求1所述的方法，其中使用液相色谱法包括使用至少一根柱。22.根据权利要求1所述的方法，其中使用液相色谱法包括平行使用两根或更多根液相色谱柱，其中所述两根或更多根液相色谱柱内联至单台质谱仪。23.根据权利要求22所述的方法，其中平行使用两根或更多根液相色谱柱包括在错开的时间将所述温育样品引入至所述两根或更多根液相色谱柱。24.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析步骤包括使用离子化技术使血清素离子化，所述离子化技术选自电喷雾离子化、大气压化学离...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·L·F·克劳弗德，Y·Z·赖特，R·P·格兰特，
申请(专利权)人：美国控股实验室公司，
类型：发明
国别省市：美国,US