一种基于生物膜干涉技术的安非他命检测方法技术

本发明专利技术公开一种基于生物膜干涉技术的安非他命检测方法。该方法是将唾液与安非他命金标抗体的混合液采用ForteBio Octet Red生物分子相互作用仪进行检测。本发明专利技术所述方法检测时间短，整个检测过程仅需5min左右，且检测灵敏度最低可达到10ng/mL。本发明专利技术所述方法可同时进行批量样本的检测，最多一次可进行80个样品的检测，而整个时间仅有30min，实现高通量样品快速检测。本发明专利技术所述方法中的光纤传感器可通过再生过程重复使用，大大降低的检测的成本。

A method for detection of amphetamine biofilm technology based on interference

The invention discloses a detection method of amphetamine biofilm technology based on interference. The method is were detected by using ForteBio Octet Red bio molecular interaction instrument of mixture of saliva and amphetamine gold labeled antibody. The method described in the invention has short detection time, only about 5min is needed in the whole detection process, and the detection sensitivity can be lowest to 10ng/mL. The method can detect lots of samples at the same time, and can detect 80 samples at a time, and the whole time is only 30min, so that high flux sample can be quickly detected. The optical fiber sensor in the method described in the present invention can be reused repeatedly through the process of regeneration, and the cost of detection is greatly reduced.

【技术实现步骤摘要】
一种基于生物膜干涉技术的安非他命检测方法
本专利技术属于毒品检测领域，尤其是批量样本检测领域，涉及一种基于生物膜干涉技术的安非他命检测方法。
技术介绍
安非他命由盐酸麻黃素合成，能兴奋中枢神经,虽具有欣快、警觉及抑制食欲之作用，重复使用会成瘾。中毒症状包括多话、头痛、错乱、高烧、血压上升、盗汗、瞳孔放大、食欲丧失。大剂量使用引起精神错乱，思想障碍，类似妄想性精神分裂症，多疑、幻听、被害妄想等。长期使用导致器官性脑症候群，有高血压及脑中风之危险。停用之脱瘾症状包括精神呆滞、昏睡、易怒、烦躁不安、忧虑，有自杀的倾向。目前安非他命的检测方法主要为胶体金法和色谱法。胶体金试纸条虽然检测方便，但其以吸毒人员尿液为检测对象，其灵敏度只有几百ng/ml，且每个试纸条每次只能检测一个人。色谱法虽然灵敏度高，但前处理过程时间较长，需要专门技术人员和大规模昂贵仪器。而本技术以其高灵敏度，可实现对待检人员的唾液进行毒品检测，从而避免因取尿对客体隐私的侵犯，并可实现在几分钟内进行80个样品的高通量检测。生物膜干涉技术生物膜干涉技术(Bio-1ayerinterferometry，BLI)是一种实时、无需标记的快速检测技术，其原理是当生物分子结合到传感器表面形成一层生物膜层，该生物膜层对透过传感器的光的波形造成干涉现象。干涉现象以相位移动的方式被检测，可以检测结合到传感器分子数量的变化。BLI技术已经成功应用于蛋白质分子间相互作用的检测，在小分子检测领域也有进一步研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速、高通量的检测待检人员唾液中安非他命含量的技术。所述检测方法取样方便，操作简单，检测快速，灵敏度高，在批量样品检测场合具有重要的应用价值。本专利技术的目的由以下技术方案实现：一种基于生物膜干涉技术的安非他命检测方法，包括如下步骤：步骤(1)：胶体金的制备。避光条件下，取一定体积的超纯水于磁力搅拌器上加热至80-90℃,按100:2的体积比加入氯金酸溶液继续加热至沸腾,再快速加入2％体积的柠檬酸三钠溶液，保持沸腾反应10min后，冷却至室温后，采用分光光度计检测520-530nm处的吸光度；所述的氯金酸溶液的质量分数为1％；柠檬酸三钠溶液的质量分数为1％；所述的胶体金的粒径为30-40nm左右，在525nm波长下有最大吸光度值；步骤(2)：金标抗体的制备。取一定体积的胶体金溶液,用碳酸钾溶液调节pH至7.2-7.4，室温搅拌10-20min；按100:1-2的体积比加入1mg/mL的安非他命单克隆抗体,室温搅拌20-30min；加入质量分数为10％的BSA溶液使其终浓度为1％；室温搅拌20-30min；4-8℃，12000rpm离心20-30min；弃上清液，留沉淀；沉淀用等体积的PBS缓冲液溶解，得到安非他命金标抗体溶液；所述的碳酸钾溶液浓度为0.2M；安非他命单克隆抗体为购买的鼠源单克隆抗体；BSA(牛血清白蛋白)溶液封闭抗体未结合的位置；PBS缓冲液的pH为7.4；步骤(3)：光纤生物传感器的制备。将APS光纤传感器的检测端没入安非他命-BSA溶液中，室温静置20-30min；再将APS光纤生物传感器没入质量含量为10％的BSA溶液中，室温静置20-30min；再将光纤生物传感器没入蔗糖溶液中，室温静置20-30min；室温晾干，置于2～8℃干燥保存；所述的APS光纤传感器是用无水乙醇配置的0.5-2M的APS(Aminopropyls-ilane,氨基丙基硅烷)浸泡普通空白光纤传感器的检测端12小时并干燥后制得的，处理后的光纤探头表面能通过蛋白的氨基固定蛋白分子；安非他命-BSA为安非他命完全抗原，即在BSA表面偶联了安非他命分子，可购买获得；安非他命-BSA溶液浓度为50-100μg/mL；蔗糖溶液浓度为15％(质量含量)；步骤(4)：待测样品准备。用棉签沾取待检人员下牙床内的唾液后，将棉签插入含有0.5-1mL溶液的EP管中并旋转混匀后弃掉棉签；EP管内的溶液待用；所述的棉签为医用一次性棉签，EP管内的溶液为步骤(2)制得的安非他命金标抗体溶液，EP管内的溶液作为后续检测的样品；步骤(5)：标准曲线的制作。采用ForteBioOctetRed生物分子相互作用仪对梯度标准品溶液进行检测，绘制标准曲线；具体过程为①8个步骤(3)制备的光纤传感器没入PBS缓冲液中30-100s进行平衡，②平衡后的8个光纤传感器分别没入0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的安非他命标准品溶液中60-100s进行梯度标准品的检测，根据检测结果，绘制标准曲线，再对标准品浓度做10为底的对数转换，得出标准品浓度和检测信号之间的函数关系，③梯度标准品检测后的8个光纤传感器没入甘氨酸-盐酸缓冲液中30-100s进行再生，④再生后的光纤传感器再没入PBS缓冲液中30-100s进行平衡；所述的具体过程可通过操作软件设置后仪器自动操作进行；甘氨酸-盐酸缓冲液的pH为1.5-2；光纤传感器经过再生后可重复使用；步骤(6)：样品检测。采用ForteBioOctetRed生物分子相互作用仪对步骤(4)的样品进行检测；检测过程为①步骤(5)平衡后的光纤传感器没入步骤(4)的样品中60-100s进行检测，②检测后的光纤传感器没入甘氨酸-盐酸缓冲液中30-100s进行再生，③再生后的光纤传感器再没入PBS缓冲液中30-100s进行平衡；将检测结果代入步骤(5)的函数中，即可求得样品中安非他命的浓度；本专利技术的有益效果：(1)本专利技术所述方法取样方便，避免检测人员在尿液取样中的不便和对待测人员隐私的侵犯。(2)本专利技术所述方法检测时间短，整个检测过程仅需5min左右，且检测灵敏度最低可达到10ng/mL。(3)本专利技术所述方法可同时进行批量样本的检测，最多一次可进行80个样品的检测，而整个时间仅有30min，实现高通量样品快速检测。(4)本专利技术所述方法中的光纤传感器可通过再生过程重复使用，大大降低的检测的成本。附图说明图1为制备的胶体金的吸光度检测结果。图2为8个梯度标准品的检测结果。图3为8个梯度标准品的标准曲线。具体实施方式下面结合实施例和附图来详述本专利技术，但不限于此。以下实施例中提到的主要试剂信息见表1；主要仪器与设备信息见表2。表1表2实施例1：(1)取100mL超纯水于磁力搅拌器上加热至90℃,加入2mL的1％氯金酸溶液继续加热至沸腾,再快速加入2mL的1％的柠檬酸三钠溶液，保持沸腾反应10min后，冷却至室温后，采用分光光度计检测，制备的胶体金的吸光度如图1所示，其λmax在525nm处，表明制备的胶体金的直径在40nm左右；(2)取胶体金溶液100ml,用碳酸钾溶液调节PH至7.2，室温搅拌10min；加入1mg安非他命单克隆抗体,室温搅拌20min；加入2mlBSA溶液封闭抗体,室温搅拌20min；4℃，12000rpm离心20min；弃上清液，留沉淀；沉淀用100mL的pH＝7.4的PBS缓冲液溶解，得到安非他命金标抗体溶液；(3)将光纤探头浸泡用无水乙醇配置的0.5M的APS溶液中12小时后干燥获得APS光纤传感器；将其末端没入50μg/mL安非他命-BS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于生物膜干涉技术的安非他命检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤(1)、金标抗体的制备将胶体金溶液调节pH至7.2‑7.4，室温下搅拌10‑20min；按100:1‑2的体积比加入1mg/mL的安非他命单克隆抗体,室温下搅拌20‑30min,加入质量分数为10％的BSA溶液使其终浓度为1％，室温下搅拌20‑30min；然后4‑8℃温度下离心,弃上清液，留沉淀；沉淀用等体积的PBS缓冲液溶解，得到安非他命金标抗体溶液；所述的胶体金的粒径为30‑40nm左右，在525nm波长下有最大吸光度值；步骤(2)：待测样品准备用棉签沾取待检人员内的唾液后，置于0.5‑1mL步骤(2)制得的安非他命金标抗体溶液中，并旋转混匀后弃掉棉签，得到所需的待测样品；步骤(3)、样品检测采用ForteBio Octet Red生物分子相互作用仪对步骤(2)待测样品进行检测，检测过程如下：①将再生平衡后的APS光纤传感器检测端浸没在步骤(2)待测样品中60‑100s进行检测；②将检测后的APS光纤传感器检测端再次再生平衡；③将检测结果代入安非他命浓度的标准曲线中，获得待测样品中安非他命的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种基于生物膜干涉技术的安非他命检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤(1)、金标抗体的制备将胶体金溶液调节pH至7.2-7.4，室温下搅拌10-20min；按100:1-2的体积比加入1mg/mL的安非他命单克隆抗体,室温下搅拌20-30min,加入质量分数为10％的BSA溶液使其终浓度为1％，室温下搅拌20-30min；然后4-8℃温度下离心,弃上清液，留沉淀；沉淀用等体积的PBS缓冲液溶解，得到安非他命金标抗体溶液；所述的胶体金的粒径为30-40nm左右，在525nm波长下有最大吸光度值；步骤(2)：待测样品准备用棉签沾取待检人员内的唾液后，置于0.5-1mL步骤(2)制得的安非他命金标抗体溶液中，并旋转混匀后弃掉棉签，得到所需的待测样品；步骤(3)、样品检测采用ForteBioOctetRed生物分子相互作用仪对步骤(2)待测样品进行检测，检测过程如下：①将再生平衡后的APS光纤传感器检测端浸没在步骤(2)待测样品中60-100s进行检测；②将检测后的APS光纤传感器检测端再次再生平衡；③将检测结果代入安非他命浓度的标准曲线中，获得待测样品中安非他命的浓度。2.如权利要求1所述的一种基于生物膜干涉技术的安非他命检测方法，其特征在于所述的安非他命浓度的标准曲线是采用ForteBioOctetRed生物分子相互作用仪对安非他命梯度标准品溶液进行检测，绘制标准曲线；具体过程为①多个APS光纤传感器的检测端浸没在PBS缓冲液中30-100s进行平衡；②平衡后的光纤传感器的检测端...

【专利技术属性】
技术研发人员：王继业，姚伟宣，吕云平，王学军，孟凡伟，
申请(专利权)人：浙江警察学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33