受试物质的检测方法及在该方法中使用的试剂盒技术

本发明专利技术涉及检测试样中的受试物质的方法及在该方法中使用的试剂盒。

Test method for subject matter and the kit used in the method

The present invention relates to a method for detecting the tested material in a sample and a kit used in the method.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】受试物质的检测方法及在该方法中使用的试剂盒
本专利技术涉及检测试样中的受试物质的方法及在该方法中使用的试剂盒。
技术介绍
作为检测试样中的受试物质的方法，已知数字检测法。数字检测法是指通过一分子一分子检测受试物质而高灵敏度地检测受试物质的方法。作为数字检测法的一例，已知专利文献1的方法。专利文献1的方法记载了称为数字ELISA，可一分子一分子检测受试物质。由此方法，首先在珠上形成含标记酶及一分子受试物质的免疫复合物。添加酶底物之后，珠被逐个封入微孔或液滴等的隔区化的区域(以下，也简称为“隔区”)。此隔区与别的隔区在空间上隔离，在隔区间不进行化合物的交换。从而，在含形成了免疫复合物的珠的隔区中，酶反应发生，荧光发生。一方面，在含未形成免疫复合物的珠的隔区中，酶反应不发生，荧光不发生。基于检测到荧光的阳性隔区而一分子一分子数字检测受试物质。【现有技术文献】【专利文献】专利文献1：美国专利申请公开第2011/0212848号说明书
技术实现思路
【专利技术要解决的技术课题】在数字检测法中，为了检测而如上述一样含一分子受试物质的隔区变得必要。为了从含多个分子受试物质的混合液调制含一分子受试物质的多个隔区，要求用于微孔或液滴形成的装置等，特殊的装置，检测操作变得烦琐。本专利技术的目的是提供不进行如上所述的隔区化而可进行数字检测的方法。【解决课题的技术方案】本专利技术提供检测试样中的受试物质的方法。此方法包括以下的工序：在载体粒子上形成含能与受试物质结合的第一捕获物质、一分子受试物质、能与受试物质结合的第二捕获物质和催化剂的复合物的工序；使复合物的催化剂和底物反应，将反应产物固定于载体粒子的工序；及，通过检测固定了反应产物的载体粒子，检测受试物质的工序。在所述方法中，由形成工序，每一个载体粒子捕获一分子受试物质；在固定工序中，反应产物固定于固定有生成该反应产物的催化剂的载体粒子，但基本上不固定于其他载体粒子；形成工序包括将试样和含多个载体粒子的试剂混合的工序。在检测工序中，各载体粒子未被隔区化。另外，本专利技术提供区别检测试样中的第一受试物质和与第一受试物质不同的种类的第二受试物质的方法。此方法包括以下的工序：在载体粒子上形成含能与第一受试物质结合的第一捕获物质、一分子第一受试物质、能与第一受试物质结合的第二捕获物质和催化剂的第一复合物，在载体粒子上形成含能与第二受试物质结合的第三捕获物质、一分子第二受试物质、能与上述第二受试物质结合的第四捕获物质和催化剂的第二复合物的工序；使复合物的催化剂和底物反应，将反应产物固定于载体粒子的工序；及，通过检测固定了反应产物的载体粒子，区别检测第一受试物质及第二受试物质的工序。将在所述方法中，形成工序包括上述试样和含多个上述载体粒子的试剂混合的工序；由形成工序，每一个载体粒子捕获一分子第一受试物质及第二受试物质之任一者；在固定工序中，反应产物固定于固定有生成该反应产物的催化剂的载体粒子，但基本上不固定于其他载体粒子；由催化反应，固定第一受试物质的载体粒子和固定了第二受试物质的载体粒子发生能互相区别的信号；在检测工序中，各载体粒子未被隔区化；在检测工序中，基于能互相区别的信号而区别检测第一受试物质及第二受试物质。再者，本专利技术提供在上述的受试物质的检测方法中使用的试剂盒。此试剂盒含多个载体粒子、第一捕获物质、第二捕获物质、催化剂和底物。【专利技术效果】由本专利技术提供无需隔区化的数字检测法。由此，不要求用于隔区化的特殊的装置或烦琐的检测操作而可简便地检测受试物质。【附图说明】【图1】是对本实施方式的方法进行说明的模式图。(A)示固定第一捕获抗体的多个载体粒子、含抗原的试样和标记了HRP的第二捕获抗体的混合工序。(B)示载体粒子上的复合物形成。(C)示荧光酪胺被自由基化的催化反应。(D)示荧光酪胺向载体粒子的固定化。【图2】是对使用检测用粒子(荧光粒子)时的本实施方式的方法进行说明的模式图。(A)示固定第一捕获抗体的多个载体粒子、含抗原的试样和标记HRP的第二捕获抗体的混合工序。(B)示载体粒子上的复合物形成。(C)示酪胺被自由基化的催化反应。(D)示向酪胺的载体粒子固定化和荧光粒子的添加。(E)示荧光粒子向固定了酪胺的载体粒子的固定化。【图3】是对使用含支持体和多个底物分子的底物(多底物体)时的本实施方式的方法进行说明的模式图。(A)示固定第一捕获抗体的多个载体粒子、含抗原的试样和标记HRP的第二捕获抗体的混合工序。(B)示载体粒子上的复合物形成。(C)示多底物体中的酪胺被自由基化的催化反应。(D)示多底物体向载体粒子的固定化。(E)示向固定于载体粒子的多底物体再结合多底物体的状态。【图4】是显示实施例2的结果的坐标图。【图5】是在实施例3中摄像的显微镜图像。【图6】是在实施例3中摄像的显微镜图像(HBs抗原浓度0.25IU/mL)的扩大图。【图7】是显示实施例4的结果的坐标图。【图8】是显示比较例1的结果的坐标图。【图9A】是显示空白磁性粒子的荧光强度分布的坐标图。【图9B】是显示使HRP聚合物(400聚体)结合的磁性粒子的荧光强度分布的坐标图。【图9C】是显示在空白磁性粒子及结合了各种聚合度的HRP聚合物的磁性粒子中的阳性珠的平均荧光强度的坐标图。【图9D】是显示阳性粒子的比例和HRP聚合物的聚合度的关系的坐标图。【图10】是在实施例6中摄像的显微镜图像(HBs抗原浓度0、0.00025、0.0025及0.025IU/mL)。【图11】是显示阳性粒子的比例和HBs抗原浓度的关系的坐标图。【图12A】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。【图12B】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。【图12C】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。【图12D】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。【图12E】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。【图13】是显示阳性粒子的比例和载体粒子的浓度的关系的坐标图。【图14】是显示固定荧光粒子的载体粒子的荧光强度分布的坐标图(HBs抗原浓度0、及0.025IU/mL)。【图15】是显示阳性粒子的比例和HBs抗原浓度的关系的坐标图。【图16A】是显示固定平均粒径160nm的荧光粒子的载体粒子的荧光强度分布的坐标图。【图16B】是显示固定平均粒径200nm的荧光粒子的载体粒子的荧光强度分布的坐标图。【图16C】是显示固定平均粒径300nm的荧光粒子的载体粒子的荧光强度分布的坐标图。【图16D】是显示固定平均粒径400nm的荧光粒子的载体粒子的荧光强度分布的坐标图。【图16E】是显示固定平均粒径500nm的荧光粒子的载体粒子的荧光强度分布的坐标图。【图17A】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。【图17B】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。【图17C】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。【图17D】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。【图17E】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。【图18】是显示实施例12的结果的坐标图。【图19A】是显示IL-6浓度和相对于平均粒径2.8μm的集团中所含的粒子数的阳性粒子的比例(％)的相关的坐标图。【图19B】是显示HBs抗原浓度和相对于平均粒径4.5μm的集团中所含的粒子数的阳性粒子数的比例(本文档来自技高网...

【技术保护点】
受试物质的检测方法，其为检测试样中的受试物质的方法，其包括：在载体粒子上形成含下列物质的复合物的工序：能与上述受试物质结合的第一捕获物质、一分子受试物质、能与上述受试物质结合的第二捕获物质、和催化剂；使上述复合物的催化剂和底物反应，将反应产物固定于上述载体粒子的工序；及通过检测固定了上述反应产物的载体粒子，检测受试物质的工序，由上述形成工序，每一个载体粒子捕获一分子受试物质，在上述固定工序中，上述反应产物固定于固定有生成该反应产物的催化剂的载体粒子，但基本上不固定于其他载体粒子，上述形成工序包括将上述试样和含多个上述载体粒子的试剂混合的工序，在上述检测工序中，各载体粒子未被隔区化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.13 JP 2015-050205;2015.08.28 JP 2015-169201.受试物质的检测方法，其为检测试样中的受试物质的方法，其包括：在载体粒子上形成含下列物质的复合物的工序：能与上述受试物质结合的第一捕获物质、一分子受试物质、能与上述受试物质结合的第二捕获物质、和催化剂；使上述复合物的催化剂和底物反应，将反应产物固定于上述载体粒子的工序；及通过检测固定了上述反应产物的载体粒子，检测受试物质的工序，由上述形成工序，每一个载体粒子捕获一分子受试物质，在上述固定工序中，上述反应产物固定于固定有生成该反应产物的催化剂的载体粒子，但基本上不固定于其他载体粒子，上述形成工序包括将上述试样和含多个上述载体粒子的试剂混合的工序，在上述检测工序中，各载体粒子未被隔区化。2.权利要求1所述的方法，其中在上述固定工序中，通过将上述反应产物固定于上述载体粒子而上述载体粒子的光学性质发生变化，在上述检测工序中，通过检测上述载体粒子的光学信息，检测上述受试物质。3.权利要求1或2所述的方法，其中上述固定工序在含固定了上述复合物的载体粒子和上述底物的溶液中执行，上述复合物的催化剂和上述底物的反应在上述载体粒子分散到上述溶液中的状态下进行。4.权利要求3所述的方法，其中在上述固定工序中，分散的载体粒子间的距离是至少3μm。5.权利要求2～4之任一项所述的方法，其中上述固定工序包括使溶液中的上述载体粒子分散的工序。6.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中在上述固定工序中，上述溶液中的载体粒子的浓度是5×104个/mL以上并且1×109个/mL以下。7.权利要求1～6之任一项所述的方法，其中上述多个载体粒子的平均粒径是100μm以下。8.权利要求1～7之任一项所述的方法，其中在上述固定工序中，在上述载体粒子上进一步固定检测用粒子。9.权利要求8所述的方法，其中上述检测用粒子是荧光粒子。10.权利要求8或9所述的方法，其中上述检测用粒子的平均粒径是上述载体粒子的平均粒径的5％以上。11.权利要求10所述的方法，其中上述检测用粒子的平均粒径是上述载体粒子的平均粒径的10％以上。12.权利要求1～11之任一项所述的方法，其中上述底物含支持体和多个底物分子。13.权利要求12所述的方法，其中上述支持体发生能检测的信号。14.权利要求13所述的方法，其中上述支持体含荧光物质。15.权利要求1～14之任一项所述的方法，其中上述检测工序在含多个载体粒子的溶液中执行，各载体粒子在上述溶液中未被隔区化。16.权利要求1～15之任一项所述的方法，其中上述底物是有标记的底物，在上述固定工序中，生成有上述标记的反应产物，有上述标记的反应产物固定于上述载体粒子，在上述检测工序中，基于固定于上述载体粒子的上述反应产物的标记，检测受试物质。17.权利要求1～16之任一项所述的方法，其中在上述检测工序中，对上述载体粒子的光学信息进行测定，对上述光学信息的测定值和指定的阈值进行比较，将上述测定值达到指定的阈值以上的载体粒子作为结合了上述反应产物的载体粒子进行检测。18.权利要求8～11之任一项所述的方法，其中在上述固定工序中，检测用粒子经反应产物而固定于载体粒子，在上述检测工序中，通过检测固定了上述检测用粒子的载体粒子，检测受试物质。19.权利要求16所述的方法，其中上述标记是荧光物质，上述光学信息是荧光强度。20.权利要求19所述的方法，其中上述荧光物质含芳香族π共轭系聚合物结构。21.权利要求1～20之任一项所述的方法，其中上述催化剂是酶。22.权利要求21所述的方法，其中上述酶是多个酶分子聚合成的聚合物。23.权利要求22所述的方法，其中上述酶分子的聚合物的聚合度是50以上并且400以下。24.权利要求1～23之任一项所述的方法，其中上述催化剂是过氧化物酶，上述底物是标记酪胺，上述反应产物是自...

【专利技术属性】
技术研发人员：赤间健司，铃木誓吾，小田健太，白井健太郎，熊本花，
申请(专利权)人：希森美康株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP