本发明专利技术提供了一种可拮抗hnRNPU蛋白RNA结合活性的多肽及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；还涉及一种抗肿瘤多肽及其应用，所述抗肿瘤多肽包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接肿瘤细胞杀伤结构域后，有明显的抑制肿瘤增殖、迁移侵袭的效应。本发明专利技术的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。
A hnRNPU protein can antagonize the RNA binding activity of HIP peptide 20 and its application
The invention provides an antagonist of hnRNPU binding protein RNA and its application in polypeptide activity, its amino acid sequence is shown as SEQ ID NO:1; also relates to an antitumor polypeptide and its application, the anti tumor peptide including tumor cell killing domain and transmembrane domain amino acid sequence domain is shown such as SEQ ID NO:1 tumor cell killing. The transmembrane domain of the anti-tumor polypeptide has no cytotoxicity in itself, but it can obviously inhibit the proliferation, migration and invasion of tumor cells after killing tumor cells. The antitumor peptide of the present invention can not only be used as an antitumor biotherapy drug alone, but also to inhibit the tumor by combining other treatment methods.
【技术实现步骤摘要】
一种可拮抗hnRNPU蛋白RNA结合活性的多肽HIP-20及其应用
本专利技术涉及肿瘤靶向治疗领域，更特别地，涉及一种可拮抗hnRNPU蛋白RNA结合活性的多肽及其应用。
技术介绍
众所周知，肿瘤是世界范围内的医学难题，给人类健康带来极大的危害。常规的肿瘤治疗药物往往组织特异性差，在杀伤肿瘤的同时对正常组织带来损伤，造成很大的副作用，给肿瘤患者带来极大的痛苦。因此，特异性高、疗效显著的肿瘤靶向性多肽药物的研发引起了人们的极大兴趣。肿瘤靶向多肽是指能够靶向肿瘤发生、发展相关的特定分子的一类活性多肽,是目前认为最理想的肿瘤靶向性治疗手段。相对于传统化疗药物，肿瘤靶向性多肽具有以下优势：1.良好的组织穿透性，极易进入肿瘤细胞发挥杀伤作用；2.生物活性高，特异性强，免疫原性低和毒性反应相对较弱；3.血浆清除速度快，在体内不易产生蓄积；4.与其他药物的相互作用较少，与体内靶标的亲和性较高；5.易于化学合成。因此，近年来许多学者努力寻找靶向肿瘤特异性分子的短肽，以达到靶向肿瘤的目的。核不均一核糖核蛋白(hnRNPs)是一组RNA结合蛋白，参与肿瘤发生、病毒感染、细胞凋亡等多种病理生理过程。其中，hnRNPU是分子量最大的磷酸化蛋白质，在基因的转录、定位和表达特别是性染色体的表观失活过程中发挥重要作用。hnRNPU多以DNA/RNA蛋白复合物形式参与细胞功能调节，且其支架结合区能够增强转录因子的功能，调控基因的转录。越来越多的研究证实：hnRNPU蛋白在多种肿瘤中高表达，并通过与体内非编码RNA的结合参与肝癌、肺癌的侵袭转移。尽管已经有许多新型抗肿瘤多肽的报道，其中部分已进入临床试验，但是，针对hnRNPU蛋白的抗肿瘤多肽尚无报道。因此，需要构建一种既能靶向肿瘤细胞，又能高效入胞的新型多肽。
技术实现思路
为解决以上问题，专利技术人深入研究了hnRNPU蛋白的作用机制，发现hnRNPU通过其RGG结构域与长链非编码RNA(LOC101927219)相互结合从而促进下游癌基因或者阻遏抑癌基因的转录。阻断hnRNPU蛋白RGG结构域与lncRNA之间的相互作用，能有效阻遏肿瘤进展。基于该研究，本专利技术提供了一种可拮抗hnRNPU蛋白RNA结合活性的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。实验证明，该多肽可竞争性拮抗促癌基因hnRNPU与LncRNA的结合，并在细胞水平表现出明显的肿瘤抑制作用。本专利技术还提供了上述可拮抗hnRNPU蛋白RNA结合活性的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术还提供了一种抗肿瘤多肽，其包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。优选地，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。优选地，所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞杀伤结构域的N端。本专利技术还提供了上述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术的优点在于，本专利技术的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接hnRNPU的RNA结合活性肽段后，在细胞水平可观察到明显的肿瘤抑制效应。本专利技术的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。附图说明图1为对照肽和HIP-20处理HeLa细胞和SH-SY5Y细胞48小时后的荧光显微镜照片；图2为用不同浓度的HIP-20或对照肽处理细胞MTT比色统计图；图3为20μmol/L的HIP-20或对照肽处理细胞不同时间的MTT比色统计图；图4为软琼脂集落形成实验照片；图5为根据图4计算的细胞克隆数的统计图；图6为Transwell细胞侵袭实验照片；图7为根据图6计算的肿瘤细胞的迁移数目的统计图；图8为肿瘤细胞的血管形成活性抑制实验照片；图9为肿瘤细胞的相对血管形成活性统计图；图10为Peptidepulldown实验照片；图11为RNA免疫共沉淀实验(RIP)照片。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.抗肿瘤多肽的合成通过固相合成法合成一种抗肿瘤多肽，其包括一个肿瘤细胞杀伤结构域和一个穿膜结构域，其中肿瘤细胞杀伤结构域序列如SEQIDNO:1所示，穿膜结构域序列如SEQIDNO:2所示，连接于肿瘤细胞杀伤结构域的N端，所得到的序列为：氨基酸序列为YGRKKRRQRRR-NMRGGNFRGGAPGNRGGYNK(SEQIDNO:3)，命名为HIP-20。为了研究方便，我们在抗肿瘤多肽的C端连接异硫氰酸荧光素标记FITC。合成从C端到N端进行，步骤如下：a.称取n当量树脂放入反应器，加入DCM(二氯甲烷)溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入序列中第一个氨基酸2n当量，加2n当量的DIEA(二异丙基乙胺)、适量的DMF(二甲基甲酰胺)、DCM(适量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜)，氮气鼓泡反应60分钟。然后加入约5n当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、MEOH洗净；b.往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为2n当量)，2n当量HBTU(1-羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐)及DIEA、氮气鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测；c.依步骤b的方式依次加入序列中不同的氨基酸并进行各种修饰；d.将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量(切割液和树脂大约以10ml/克的比例)的切割液(组成是95％TFA、2％乙二硫醇、2％三异丙基硅烷、1％水)，震荡，滤掉树脂；得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列的粗产物；多肽纯化：反相HPLC法纯化粗品，多肽通过疏水作用连接到柱填料上，渐次降低离子强度进行洗脱。采用紫外分光光度法测定多肽紫外吸收来定量。2.HIP-20的穿膜与细胞定位检测分别采用人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y和人宫颈癌细胞系HeLa进行实验。取对数生长期的细胞，种植在24孔板内的盖玻片上，每孔约8000-10000个细胞。以10％胎牛血清、高糖DMEM培养基培养，并加入20μmol/L的多肽，维持48小时。弃去上清，加入4％多聚甲醛300μl/孔，室温固定细胞20分钟，弃去多聚甲醛，1×PBS清洗两次，每次5分钟。加入DAPI溶液300μl/孔，室温染细胞核5分钟，1×PBS充分洗涤5次，每次5分钟。然后以胞膜染料2μmol/L浓度200μl/孔，室温染细胞膜5-10分钟，染膜过程中保持震荡，随后1×PBS充分洗涤5次，每次5分钟。纯甘油封片，将盖玻片固定于载玻片上。采用激光共聚焦显微镜检测带有荧光基团的多肽在细胞内的定位，拍照并保存。结果如图1所示，该多肽在加入细胞培养体系48小时之后，能有效进入肿瘤细胞，并显示极强的胞核定位。而对照肽仅能部分进入细胞浆，极少量分布在细胞核。可见该多肽能够有效进入肿瘤细胞并定位于胞核内。3.MTT比色法分析检测HIP-20对肿瘤细胞生长的抑制作用分别使用人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y进行MTT细胞活力比色实验。在96孔细胞培养板中，每孔种植5000个细胞，每个样品设定8个复孔。12小时后，加入HIP-20及对照肽。首先给予0.05、0.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可拮抗hnRNPU蛋白RNA结合活性的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种可拮抗hnRNPU蛋白RNA结合活性的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.权利要求1所述的可拮抗hnRNPU蛋白RNA结合活性的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。3.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如...
【专利技术属性】
技术研发人员：童强松，郑丽端，宋华杰，杨枫，方二虎，王晓静，叶霖，李聃，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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