一种基于II型胶原酶的离体兔角膜扩张模型及构建装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开一种基于II型胶原酶的离体角膜扩张模型的构建方法及实现该离体角膜扩张模型的装置。本发明专利技术作为一种研究工具，其构建该离体角膜扩张模型的装置包括人工前房、离体角膜以及角膜浸泡处理剂等，其构建步骤包括：将离体的角膜置于人工前房上，得到装有角膜的人工前房；降低所述人工前房压力，使角膜中央出现凹面；向凹面处滴加浸泡液，对角膜进行浸泡处理，得到其角膜经浸泡处理的人工前房；然后维持人工前房的压力和控制浸泡时间，最后得到角膜曲率增加的角膜扩张模型。本发明专利技术设计符合最小量化的手术及动物制模原则，实验操作简单、可重复性好；该离体的角膜扩张模型可用来进一步探讨圆锥角膜发病机制和安全有效的治疗方法。

A rabbit corneal dilatation model and construction device based on II collagenase in vitro

The invention discloses a method for constructing an isolated corneal dilatation model based on II collagenase and a device for the realization of the isolated corneal dilatation model. The invention is used as a research tool, the construction of the device in vitro corneal expansion model including artificial anterior chamber, isolated cornea and corneal soaking agent, which comprises the following steps: constructing the excised cornea in artificial anterior chamber, with the artificial cornea anterior chamber; reduce the artificial anterior chamber pressure, the central cornea appear to the concave concave; adding soaking liquid, on the cornea were soaked, the cornea soaked through artificial anterior chamber; then maintaining pressure and soaking time control artificial anterior chamber, the corneal expansion model of corneal curvature increased. The design accords with the principle of minimum quantification operation and animal modeling, and the experimental operation is simple and repeatable. The corneal expansion model in vitro can be used to further explore the pathogenesis and safe and effective treatment of keratoconus.

【技术实现步骤摘要】
一种基于II型胶原酶的离体兔角膜扩张模型及构建装置
本专利技术涉及医学动物模型
，尤其涉及一种基于II型胶原酶的离体兔角膜扩张模型及构建装置。
技术介绍
圆锥角膜是一种非炎性角膜扩张性疾病，它可导致角膜中央或旁中央进行性变薄膨出、高度散光或角膜瘢痕，严重影响患者视力。圆锥角膜多在青春期发病，据报道该病发病率约为1/2000。临床上圆锥角膜以散发独立病例较为常见，但圆锥角膜可与许多疾病相关，包括某些先天性遗传病如Down综合征、Marfan综合征等和某些结蹄组织异常疾病如Ehlers-Danlos综合征、二尖瓣脱垂等。目前圆锥角膜病因尚不清楚，通常认为圆锥角膜是由环境因素和遗传因素共同作用引起的。圆锥角膜动物模型可模拟临床上圆锥角膜的病理状态，为探索圆锥角膜的发病机制和指导圆锥角膜的治疗提供极大便利。但遗憾地是，目前尚无理想的圆锥角膜模型。在圆锥角膜中可发现许多细胞因子和酶的表达发生改变，有学者认为蛋白水解酶和下调的蛋白酶抑制剂可导致胶原退化，从而引起角膜基质变薄。WilliamJ.Dupps等(HongCW,Sinha-RoyA,SchoenfieldL,McMahonJT,DuppsWJJr.Collagenase-mediatedtissuemodelingofcornealectasiaandcollagencross-linkingtreatments[J].InvestOphthalmolVisSci,2012,53:2321–2327.)报道可在人离体角膜上应用II型胶原酶构建角膜扩张模型，并对该模型进行GXL手术(角膜胶原交联手术)治疗，效果良好。因此，局部应用胶原酶建立角膜扩张模型存在一定可行性。无论是为了研究圆锥角膜发病机制，还是探索安全有效的治疗方法，均需要有效可靠的离体角膜扩张模型。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是建立一种有效可靠的角膜扩张模型，为探索圆锥角膜的发病机制和治疗方法提供极大便利。为实现本专利技术的目的，本专利技术一方面提供一种角膜扩张模型的构建方法，包括：将离体的角膜置于人工前房上，保持角膜内皮面朝下，得到装有角膜的人工前房；降低所述人工前房压力，使角膜中央出现凹面；通过角膜中央出现凹面对角膜进行浸泡处理，得到其角膜经浸泡处理的人工前房；通过将其角膜经浸泡处理的人工前房的压力调节到15-50mmHg，得到角膜曲率增加的角膜扩张模型。优选地，所述将离体的角膜置于人工前房上，并调节所述人工前房压力可以是15mmHg。尤其是，所述浸泡处理包括：向所述角膜中央的凹面滴入Ⅱ型胶原酶溶液，对所述角膜进行浸泡处理；在所述浸泡处理结束后，去除角膜上的Ⅱ型胶原酶溶液。尤其是，所述的去除角膜上的Ⅱ型胶原酶溶液包括：使用无菌棉签吸干角膜上的Ⅱ型胶原酶溶液；利用PBS溶液冲洗所述吸干Ⅱ型胶原酶溶液后的角膜，得到去除Ⅱ型胶原酶溶液的角膜。其中，所述对角膜进行浸泡处理的时间为40-60min；优选的，所述对角膜进行浸泡处理的时间为50min。其中，所述Ⅱ型胶原酶溶液的滴入量为10-25mg/ml。其中，所述Ⅱ型胶原酶溶液包含质量百分数为10-24％的右旋糖酐。其中，所述角膜为兔角膜。为实现本专利技术的目的，本专利技术另一方面提供一种实现角膜扩张模型的装置，包括：人工前房；安装在人工前房上的离体角膜；角膜浸泡处理剂，用于对其中央出现凹面的角膜进行浸泡处理，得到其角膜得到浸泡处理的人工前房；其中，所述压力调节装置还用于通过将其角膜经过浸泡处理的人工前房压力调节到15-20mmHg，得到角膜曲率增加的角膜扩张模型。其中，所述的角膜浸泡处理剂包括：作用于角膜上，用于浸泡角膜的Ⅱ型胶原酶溶液和用于冲洗角膜的PBS溶液。其中，所述II型胶原酶溶液的使用量为10-25mg/ml。其中，所述II型胶原酶溶液包含质量百分数为10-24％的右旋糖酐和PBS溶液。本专利技术的优点在于：1、本专利技术提供的角膜扩张模型的构建方法简单，仅需要调节人工前房的压力，并滴加Ⅱ型胶原酶溶液对角膜进行浸泡就可以得到。2、本专利技术提供的角膜扩张模型仅需要角膜、人工前房和Ⅱ型胶原酶溶液，因此，获得该模型的成本低，且容易获得。3、本专利技术提供的角膜扩张模型的曲率增加与与临床圆锥角膜的曲率增加的病理状态一致，可用于圆锥角膜曲率变化机理研究。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。材料：新西兰大耳白兔：北京大学第一医院实验动物中心提供的采自健康雌性成年体重2.0-3.0kg，25只，眼部检查未见异常的新西兰白兔。II型胶原酶(美国Worthington公司)右旋糖苷(美国Adamas公司)人工前房(美国Moria公司)器具：手持电子角膜曲率计(天津市索维电子技术有限公司)；手持角膜超声测厚仪(美国Accutome公司)回弹式眼压计(芬兰iCare公司)实施例11、角膜的获取术前对5只实验兔进行常规裂隙灯、直接眼底线、角膜曲率、中央角膜厚度等检查，排除眼前节病变。将5％戊巴比妥钠注射液以1ml/Kg行实验兔耳缘静脉快速推注，使实验兔中枢神经过度抑制而死亡，快速取得5只实验兔的右眼眼球，并采用眼科手术刀去掉上皮，取下完整的角膜。2、II型胶原酶溶液的配制2.1PBS溶液的配制将0.27g的磷酸二氢钾(KH2PO4)、1.42g的磷酸氢二钠(Na2HPO4)、8g的氯化钠(NaCl)、0.2g的氯化钾(KCl)用800mL的去离子水充分搅拌溶解，定容到1L，并使用浓盐酸调pH至7.4，得到PBS溶液。2.2II型胶原酶溶液的配制将10mg右旋糖酐粉末和2.5gII型胶原酶粉末溶解于100ml的PBS缓冲液中，轻轻涡旋振荡，使其充分溶解，然后用低蛋白结合的0.22um的滤膜过滤除菌，分装成小份量，-20℃保存避光冻存。3、圆锥角膜模型的建立将步骤1获得的兔角膜内皮面朝下置于人工前房之上，采用手持角膜曲率计检测角膜曲率并记录实验处理前的角膜曲率Ki(i＝1、2、3、4、5)，随后通过调节前房内的生理盐水量控制人工前房压力，使其压力保持为15mmHg，使角膜中央出现凹面，此时吸取步骤2配制的浓度为25mg/ml的II型胶原酶溶液200ul，滴入角膜凹面内，对角膜进行浸泡处理，时间为50min；随后以无菌棉签吸干角膜凹面内溶液，PBS溶液冲洗干净后，采用手持角膜曲率计检测实验处理后的角膜曲率并记录实验处理后的角膜曲率Kj(j＝1、2、3、4、5)，观察并分析角膜曲率变化。4、结果分析运用SPSSl7.0统计学软件对步骤3中处理前后角膜平均曲率Km采用正态分布及Levene方差齐性检验和单因素方差分析。实验数据结果如表1所示，其中，所述角膜的平均曲率Km＝1/5(K1+K2+K3+K4+K5)，Ki为实验处理前数据，Kj为实验处理后数据，⊿Km为处理前后的角膜平均曲率的差值，即⊿Km＝⊿Kmj-⊿Kmi；数据结果以均数±标准差表示；P<0.05为差异有统计学意义。实施例21、角膜的获取术前对5只实验兔进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种角膜扩张模型的构建方法，其特征在于，包括：将离体的角膜置于人工前房上，保持角膜内皮面朝下，得到装有角膜的人工前房；降低所述人工前房压力，使角膜中央出现凹面；通过角膜中央出现凹面对角膜进行浸泡处理，得到其角膜经浸泡处理的人工前房；维持经浸泡处理的人工前房的压力并控制浸泡时间，得到角膜曲率增加的角膜扩张模型。

【技术特征摘要】
1.一种角膜扩张模型的构建方法，其特征在于，包括：将离体的角膜置于人工前房上，保持角膜内皮面朝下，得到装有角膜的人工前房；降低所述人工前房压力，使角膜中央出现凹面；通过角膜中央出现凹面对角膜进行浸泡处理，得到其角膜经浸泡处理的人工前房；维持经浸泡处理的人工前房的压力并控制浸泡时间，得到角膜曲率增加的角膜扩张模型。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浸泡处理包括：向所述角膜中央的凹面滴II型胶原酶溶液，对所述角膜进行浸泡处理；在所述浸泡处理结束后，去除角膜上的II型胶原酶溶液。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的去除角膜上的II型胶原酶溶液包括：使用工具吸干角膜上的II型胶原酶溶液；利用PBS溶液冲洗所述吸干II型胶原酶溶液后的角膜，得到去除II型胶原酶溶液的角膜。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔静，晏晓明，汤韵，宋文静，李海丽，荣蓓，杨松霖，吴元，
申请(专利权)人：北京大学第一医院，
类型：发明
国别省市：北京,11