一种基于同源重组的裂殖壶菌基因表达系统的构建及应用技术方案

一种基于同源重组的裂殖壶菌基因表达系统的构建及应用，涉及基因工程及微生物发酵。利用构建的基因表达系统pBluZeo‑MAT‑18S，通过电转化方式导入裂殖壶菌LU310感受态细胞，经摇瓶发酵测定，MAT过表达能够在一定程度上促进裂殖壶菌的DHA合成。此外，基因表达系统pBluZeo‑MAT‑18S也可用于其他外源基因的重组表达，为从基因水平提高裂殖壶菌DHA发酵产量及深入研究DHA合成途径关键酶奠定基础。

Construction and application of a gene expression system based on homologous recombination

Construction and application of a gene expression system based on homologous recombination, involving genetic engineering and microbial fermentation. The expression of pBluZeo MAT 18S system constructed by gene by electroporation into Schizochytrium LU310 competent cells by fermentation determination, overexpression of MAT can promote DHA synthesis of Schizochytrium in a certain extent. In addition, gene expression system pBluZeo MAT 18S can also be used for other exogenous gene expression, from gene level to improve the basis of Schizochytrium DHA fermentation yield and in-depth study of DHA biosynthesis key enzyme.

【技术实现步骤摘要】
一种基于同源重组的裂殖壶菌基因表达系统的构建及应用
本专利技术涉及基因工程及微生物发酵，尤其是涉及一种基于同源重组的裂殖壶菌基因表达系统的构建，以及一株过表达丙二酸单酰转移酶基因的裂殖壶菌基因工程菌。
技术介绍
二十二碳六烯酸(DocosahexaenicAcid，DHA)，俗称“脑黄金”，是人体细胞膜中含量最丰富的Omega-3(也称ω-3或n-3)多不饱和脂肪酸，具有健脑益智、保护视力和防治心血管疾病等重要的生理功能(CrawfordP.1987；BirchEE.etal.2002；UauyR.etal.2006)，被广泛添加于婴幼儿食品和保健品中(AgrenJJ.etal.1996；SmithJrSC.etal.2006)，市场前景十分巨大。裂殖壶菌是优良的DHA发酵生产菌株，具有油脂含量高、不饱和脂肪酸组成简单及易于分离纯化等优点，但其DHA产量仍不能适应市场化生产的需求。传统的提高裂殖壶菌DHA发酵产量的手段，大部分集中于菌种筛选、培养基优化和发酵策略调控，近年来已逐渐陷入瓶颈。随着基因工程技术的不断发展，从基因水平调控DHA合成途径的代谢流，使裂殖壶菌的DHA发酵产量得到根本性的提高，已受到越来越多的关注。Yan等(YanJF.etal.2013)在裂殖壶菌中过量表达了乙酰辅酶A合成酶，从而提高了裂殖壶菌TCA循环的代谢能力，虽然DHA产量未得到明显提高，但由于生物量提高了将近30％，因此单位发酵液的DHA产量还是获得了较大的提高。Ren等(RenLJ.etal.2015)将ω-3脱氢酶在裂殖壶菌中异源表达，重组菌有3％的DPA转化成了DHA，油脂中鲨烯和甾醇的含量分别减少了37.19％和22.31％。Cui等(CuiGZ.etal.2016)在裂殖壶菌中过量表达了葡萄糖6磷酸脱氢酶，从而改变了脂肪酸的组成，使多不饱和脂肪酸在脂肪酸中的占比提高了10.6％。由于裂殖壶菌细胞中无稳定的附加质粒，因此要使外源基因稳定遗传，就必须构建裂殖壶菌的基因表达系统，将外源基因整合到裂殖壶菌的基因组中。此外，目前裂殖壶菌的DHA合成途径还处于探索阶段，要对DHA合成相关的关键酶及调控因子深入研究，从而建立DHA合成的代谢网络模型，也必须先构建裂殖壶菌的基因表达系统。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)LU310。本专利技术的第二目的在于提供一株过表达丙二酸单酰转移酶基因的裂殖壶菌LU310基因工程菌。本专利技术的第三目的在于提供基于同源重组的裂殖壶菌基因表达系统的构建方法。本专利技术的第四目的在于提供基于同源重组的裂殖壶菌基因表达系统的应用。所述裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)LU310，已于2016年07月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.12528。所述一株过表达丙二酸单酰转移酶(Malonyltransferase，MAT)基因的裂殖壶菌LU310基因工程菌，利用基因表达系统将MAT基因重组至裂殖壶菌LU310的基因组，使之能够稳定遗传并过表达MAT基因，从而在一定程度上提高了DHA的发酵产量。所述基于同源重组的裂殖壶菌基因表达系统为构建的pBluZeo-MAT-18S，表达载体以18SrDNA的部分片段作为上、下游同源臂，以博来霉素(Zeocin)基因为抗性筛选标记，以TEF1启动子和CYC1终止子组成基因表达框并于二者之间插入外源基因。所述一株过表达丙二酸单酰转移酶(Malonyltransferase，MAT)基因的裂殖壶菌LU310基因工程菌的构建方法，包括裂殖壶菌LU310的感受态细胞制备及电转化方法，具体步骤如下：1)取二级活化后的裂殖壶菌，加入细胞壁疏松剂，震荡；2)预冷的无菌水洗涤两次，再预冷的山梨醇溶液洗涤两次；3)用1M无菌预冷山梨醇溶液重悬菌体，分装于无菌离心管，冰上备用；4)取线性化后的质粒加入感受态细胞，混匀后转移至预冷的电转杯，冰上静置；5)电击；6)往电转杯加入预冷的含山梨醇的种子培养基，混匀后转移至预冷的含山梨醇的种子培养基培养；7)取菌液涂于抗性筛选板培养；8)挑取单菌落培养，提取基因组进行PCR验证。在步骤1)中，所述二级活化后的裂殖壶菌可取5mL；所述加入细胞壁疏松剂，可加入25mL细胞壁疏松剂，含25mMDTT的20mMpH6.5磷酸盐缓冲液；所述震荡的时间可为30min。在步骤2)中，所述预冷的无菌水洗涤两次，再预冷的山梨醇溶液洗涤两次，可20mL预冷的无菌水洗涤两次，再20mL预冷的1M山梨醇溶液洗涤两次。在步骤3)中，所述用1M无菌预冷山梨醇溶液重悬菌体，分装于无菌离心管，可用200μL的1M无菌预冷山梨醇溶液重悬菌体，分装于1.5mL的无菌离心管，每管100μL。在步骤4)中，所述线性化后的质粒可取10μL，质粒大于3μg，所述感受态细胞可加入100μL感受态细胞，所述静置的时间可为30min。在步骤5)中，所述电击可采用2kV，一个脉冲。在步骤6)中，所述往电转杯加入预冷的含山梨醇的种子培养基，可往电转杯加入1mL预冷的含1M山梨醇的种子培养基；所述混匀后转移至预冷的含山梨醇的种子培养基培养，可将混匀后转移至预冷的含1M山梨醇的4mL种子培养基，28℃，200rpm培养2～3h；所述种子培养基可装入25mL锥形瓶。在步骤7)中，所述培养的条件可在28℃下培养2～4d。本专利技术利用该基因表达系统表达与裂殖壶菌DHA合成相关的丙二酸单酰转移酶(Malonyltransferase，MAT)基因。丙二酸单酰转移酶催化丙二酰辅酶A(MalonylCoA)和酰基载体蛋白(Acylcarrierprotein，ACP)反应生成丙二酰载体蛋白(MalonylACP)，丙二酰载体蛋白作为碳链延长骨架参与后续的脂肪酸合成，最终生成DHA。因此表达MAT基因有助于提高裂殖壶菌的DHA发酵产量。以真菌表达载体pBluescriptIISK(-)为构建骨架，TEF1为启动子，CYC1为终止子，博来霉素(Zeocin)基因为抗性筛选标记，裂殖壶菌LU31018SrDNA部分片段作为上、下游同源臂，以MAT基因为外源基因，构建基于同源重组的裂殖壶菌基因表达系统pBluZeo-MAT-18S。然后利用电转化方式导入裂殖壶菌LU310感受态细胞，之后于含Zeocin的抗性平板筛选重组菌，再对重组菌进行基因水平的鉴定。裂殖壶菌基因过表达系统pBluZeo-MAT-18S的构建方法包括以下步骤：1)设计带有双酶切位点的PCR引物，克隆TEF1启动子基因、CYC1终止子基因、Zeocin基因、裂殖壶菌LU31018SrDNA的上游片段和下游片段、MAT基因，构建至pMD19-T载体后热激转化至大肠杆菌DH5α保存以备后续的构建之用。2)将步骤1)中的各基因按酶切连接的方式构建至pBluescriptIISK(-)，热激转化至大肠杆菌DH5α保存。构建一种基于同源重组的裂殖壶菌基因表达系统，使外源基因重组至裂殖壶菌基因组，从而得到稳定遗传并过量表达，进而从基因水平上提高裂殖壶菌的DHA发酵产量，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)LU310，已于2016年07月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12528。

【技术特征摘要】
1.裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)LU310，已于2016年07月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.12528。2.一株过表达丙二酸单酰转移酶(Malonyltransferase，MAT)基因的裂殖壶菌LU310基因工程菌，利用基因表达系统将MAT基因重组至裂殖壶菌LU310的基因组，稳定遗传并过表达MAT基因。3.基于同源重组的裂殖壶菌基因表达系统为构建的pBluZeo-MAT-18S，表达载体以18SrDNA的部分片段作为上、下游同源臂，以博来霉素基因为抗性筛选标记，以TEF1启动子和CYC1终止子组成基因表达框并于二者之间插入外源基因。4.一株过表达丙二酸单酰转移酶(Malonyltransferase，MAT)基因的裂殖壶菌LU310基因工程菌的构建方法，其特征在于包括裂殖壶菌LU310的感受态细胞制备及电转化方法，具体步骤如下：1)取二级活化后的裂殖壶菌，加入细胞壁疏松剂，震荡；2)预冷的无菌水洗涤两次，再预冷的山梨醇溶液洗涤两次；3)用1M无菌预冷山梨醇溶液重悬菌体，分装于无菌离心管，冰上备用；4)取线性化后的质粒加入感受态细胞，混匀后转移至预冷的电转杯，冰上静置；5)电击；6)往电转杯加入预冷的含山梨醇的种子培养基，混匀后转移至预冷的含山梨醇的种子培养基培养；7)取菌液涂于抗性筛选板培养；8)挑取单菌落培养，提取基因组进行PCR验证。5.如权利要求4所述一株过表达丙二酸单酰转移酶(Malonyltransferase，MAT)基因的裂殖壶菌LU310基因工程菌的构建方法，其特征在于在步骤1)中，所述二级活化后的裂殖壶菌取5mL；所述加入细胞壁疏松剂，加入25mL细胞壁疏松剂，含25mMDTT的20mMpH6.5磷酸盐缓冲液；所述震荡的时间为30min。6.如权利要求4所述一株过表达丙二酸单酰转移酶(Malonyltransferase，MAT)基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：凌雪萍，郑楚强，卢英华，李俊，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35