一种检测犬瘟热病毒的巢式NEST‑PCR的试剂盒制造技术

本实用新型专利技术提供一种检测犬瘟热病毒的巢式NEST‑PCR的试剂盒，包括有包装盒(1)，内衬(2)，在内衬(2)上设有数个定位孔，通过定位孔将试剂管安装定位其内部，所述试剂管包括并列安装的：PCR缓冲液管(3)，普通上游引物管(4)、普通下游引物管(5)、巢式上游引物管(6)、巢式下游引物管(7)、酶管(8)、去离子水管(9)、阴性对照管(10)、阳性对照管(11)、氯化镁管(12)、dNTP管(13)。采用本试剂盒可在反应体系中快速检测出是否有犬瘟热病毒感染，具有较高的特异性和敏感性，从而节省时间和试剂，可以为快速和早期诊断提供有效的工具。

A kit for detection of canine distemper virus by nested NEST PCR

The utility model provides a kit for detection of canine distemper virus nested NEST PCR, including a packing box (1), (2), in the inner lining (2) is provided with a plurality of locating holes through the positioning hole to reagent tube installation and positioning inside the test tube includes parallel installation: PCR the buffer tube (3), common pipe (4), the upstream primer and downstream primer of ordinary tube (5), nested primer tube (6), nested primer tube (7), (8) tube of enzyme and deionized water (9), negative control (10), positive control (11) magnesium chloride tube (12), dNTP (13). The kit can detect the canine distemper virus infection rapidly in the reaction system, which has high specificity and sensitivity, thus saving time and reagents, and can provide an effective tool for rapid and early diagnosis.

【技术实现步骤摘要】
一种检测犬瘟热病毒的巢式NEST-PCR的试剂盒
本技术是一种检测犬瘟热病毒的巢式NEST-PCR的试剂盒，属于动物病毒的检测领域，专一针对犬瘟热病毒的巢式NEST-PCR的试剂盒，适用于犬瘟热病毒的快速检测。
技术介绍
犬瘟热病(Caninedistemper，CD)是由副粘病毒科麻疹病毒属禽犬瘟热病毒(CDV)引起的犬科、鼬科及部分浣熊科动物的一种高度接触性、致死性传染病(文献1)。特征表现为病毒粒子有囊膜，直径大小约为150nm，包括一个线性、负义单链RNA基因组，大小约为15.0kb，病毒只有一个血清型。该病的传染性极强，死亡率可高达80％以上，病程早期双相体温热型，眼、鼻、消化道等粘膜炎症，随后以支气管炎、卡他性肺炎、胃肠炎为特征。病后期可见有神经症状出现如痉挛、抽搐，部分病例可出现鼻部和角垫高度角化，并可继发肺炎、肠炎等症状(文献2)。传染源主要是病犬、病兽和带毒动物，其中患犬瘟热的病犬是最危险的传染源。主要是通过患病动物的眼、鼻分泌物、唾液、尿和粪便排出病毒(文献3)。快速诊断该病对控制犬瘟热病的大规模流行有着积极的意义。巢式RT-PCR是一种变异的RT-PCR,使用两对RT-PCR引物。第1对RT-PCR引物扩增片段和普通RT-PCR相似。第2对引物称为巢式引物(因为其在第1次RT-PCR扩增片段的内部)结合在第1次RT-PCR产物内部,使得第2次RT-PCR扩增片段短于第1次扩增。巢式RT-PCR的好处在于,如果第1次扩增产生了错误片段,则第2次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此,巢式RT-PCR的扩增非常特异。杨井泉等建立了CDV巢式RT-PCR检测方法,并用此法对石河子地区疑似感染CDV的病料进行检测,结果表明该研究建立的巢式RT-PCR不仅能有效检测CDV感染,而且能够检测多种组织样品,补充了形态学、理化和生物学鉴定的不足,减少RT-PCR的误检率,适用于CDV的早期快速诊断和流行病学调查。Fischer等采用巢式实时荧光定量RT-PCR(RT-nqPCR)方法分别对疑似患犬瘟热病犬的血液、尿液、直肠黏膜拭子和结膜拭子进行检测,结果显示血液的检出率最高。该方法需经过两轮PCR反应,与普通RT-PCR反应相比大大提高了反应的特异性,比免疫层析技术(IC)的敏感性更高,该方法可用于CDV的临床检测和流行病学监测,具有很强的特异性。近年来随着宠物养殖、毛皮动物(水貂等)养殖业的不断发展，以具备相当数量的产业化规模。同时作为养殖业的3大疫病之一的犬瘟热病已在主要养殖区域大规模流行与传播，严重影响动物养殖业发展，对农业经济发展、社会稳定和人类健康也带来不良影响。这种疫病的常规诊断方法是病毒分离鉴定、血凝实验、琼脂扩散试验、对流免疫电泳和动物感染实验等(文献1-4)，这些方法都存在敏感性低，特异性不足，操作费时费力等局限性。因此，建立一种快速、敏感、特异、简便的同时检测这种病毒的分子生物学方法有着重要的意义，并对病毒的复合感染诊断有着积极的帮助。参考文献1杨应丽.犬瘟热病毒研究进展.河北农业科学.2006.(4)：99-102.2高大潮.犬瘟热病的诊治.现代农业科技.2009(9)：255.3赵新龙.犬瘟热病流行特点和诊治.中国畜禽种业.2009(12)：924王好，张宇，钱爱东.犬瘟热诊断方法的研究进展.畜牧与饲料科学.2009(10)：67-69
技术实现思路
本技术的目的在于避免现有技术的不足提供一种检测犬瘟热病毒的巢式NEST-PCR的试剂盒。为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：一种检测犬瘟热病毒的巢式NEST-PCR的试剂盒，一种检测犬瘟热病毒的巢式NEST-PCR的试剂盒，其特征在于，包括有包装盒(1)，内衬(2)，在内衬(2)上设有数个定位孔，通过定位孔将试剂管安装定位其内部，所述试剂管包括并列安装的：PCR缓冲液管(3)，普通上游引物管(4)、普通下游引物管(5)、巢式上游引物管(6)、巢式下游引物管(7)、酶管(8)、去离子水管(9)、阴性对照管(10)、阳性对照管(11)、氯化镁管(12)、dNTP管(13)。更优选的，为了获得更好的区别效果，普通上游引物管(4)为棕色管，普通下游引物管(5)为蓝色管；更优选的，为了获得更好的区别效果，巢式上游引物管(6)为红色管，巢式下游引物管(7)为橙色管。上述各种液体分别装在容器内，插入定位孔内。所述的核苷酸序列为：普通上游引物；5’-CTTGCTTAGGTATTACACCGAGT-3’普通下游引物；5’-CTGATTCTGAGACGAATACAC-3’巢式上游引物；5’-TTCATAAGATACTTGAGAAG-3’巢式下游引物：5’-CCATTAGTTGCAATATACCTC-3’其中，所述的1个阳性对照为MD77犬瘟热病毒株(中国动物疫病预防控制中心提供)。所述的阴性对照是蒸馏水。PCR反应程序为：第一轮42℃45min；95℃3min；95℃30s,58℃30s，72℃，40s35Cycle；72℃7min.4℃∞。第二轮95℃3min；95℃30s,50℃30s，72℃，30s30Cycle；72℃7min，4℃∞。判定结果：如果从待检测的样品中扩增到了244bp片段，则该检测样品含有犬瘟热病毒。本技术的有益效果是：本技术一种检测犬瘟热病毒的巢式NEST-PCR的试剂盒，涉及一种检测危险性病原体的分子技术，尤其是能快速、简便、准确的检测病原体的试剂盒，在12小时内就可以完成检测。通过对犬瘟热病毒的特异性检测，优化的PCR条件对目标菌株扩增得到了目标PCR产物，可以特异的检测目标菌。但是对于8种非目标菌，均无扩增产物。通过灵敏度的检测，对犬瘟热病毒的直接PCR和Nest-PCR检测比较，发现直接进行PCR扩增的最低检出限为0.8326ng/ul，而Nested-PCR的最低检出量是0.08326ng。通过对犬瘟热病毒检测，均可从患病动物中准确稳定的检测到目标PCR产物，和ELISA检测符合率为90％，且有10％的ELISA未检测到的患病动物，该试剂盒也可以检测到目标条带，说明该试剂盒比ELISA试剂盒更加灵敏。本技术的积极效果是1根据病毒基因组的保守基因序列设计引物，得到了检测犬瘟热病毒的巢式NEST-PCR的试剂盒。与常规的PCR方法相比采用本技术的试剂盒可以在不同反应体系中检测是否含有犬瘟热病毒，具有较高的特异性和敏感性，可以对动物兽群中隐形感染或者持续带毒宿主和发病动物进行准确检测。2本项技术中的巢式NEST-PCR的试剂盒可对细胞培养物、组织、分泌液、血液等多种样品的CDV进行快速检测，样品适用范围广，试剂盒提供的试剂中，无感染性、无生物安全隐患成分，使用安全性很高。3本项技术中的试剂所组成的试剂盒可在收到样品6小时候进行定性诊断结果，为诊断犬瘟热病毒感染提供有效工具。附图说明图1是本技术的立体示意图；图2技术实施例2中的检测结果，其中M代表DNA2000Marker,1代表MD77病毒株，2代表阴性对照。图3本技术的敏感性实验一轮PCR结果，其中M代表DNA2000Marker,1代表00、2代表10-1、3代表10-2、4代表10-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测犬瘟热病毒的巢式NEST‑PCR的试剂盒，其特征在于，包括有包装盒(1)，内衬(2)，在内衬(2)上设有数个定位孔，通过定位孔将试剂管安装定位其内部，所述试剂管包括并列安装的：PCR缓冲液管(3)，普通上游引物管(4)、普通下游引物管(5)、巢式上游引物管(6)、巢式下游引物管(7)、酶管(8)、去离子水管(9)、阴性对照管(10)、阳性对照管(11)、氯化镁管(12)、dNTP管(13)；普通上游引物管(4)为棕色管，普通下游引物管(5)为蓝色管；巢式上游引物管(6)为红色管，巢式下游引物管(7)为橙色管。

【技术特征摘要】
1.一种检测犬瘟热病毒的巢式NEST-PCR的试剂盒，其特征在于，包括有包装盒(1)，内衬(2)，在内衬(2)上设有数个定位孔，通过定位孔将试剂管安装定位其内部，所述试剂管包括并列安装的：PCR缓冲液管(3)，普通上游引物管(4)、普通下游引物管(5)、巢式上游...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹振，赵化芬，王彦兵，高振刚，杨雪松，
申请(专利权)人：中瑞动检北京生物技术有限公司，
类型：新型
国别省市：北京,11