一种软骨细胞冻存保护液及其应用和软骨细胞冻存方法技术

本发明专利技术涉及医学领域，公开了一种软骨细胞冻存保护液及其应用和软骨细胞冻存方法。本发明专利技术所述冻存保护液包括DMSO、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子；所述脐带间充质干细胞生长因子为脐带间充质干细胞经1640培养基培养后的培养基上清液冻干粉。本发明专利技术以DMSO、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子作为冻存保护液的组分，通过各组分的相互作用，可有效保护软骨细胞冻存，并在复苏后维持软骨细胞回收率和存活率在较高水平，同时提高细胞增殖能力，显著优于同类保护液。

A cartilage cell cryopreservation protective solution and its application and cartilage cell cryopreservation method

The present invention relates to the field of medicine, and discloses a cartilage cell cryopreservation protective solution and its application and cartilage cell cryopreservation method. The cryopreservation protection solution of the invention includes DMSO, fetal bovine serum and umbilical cord mesenchymal stem cell growth factor; the umbilical cord mesenchymal stem cell growth factor is the freeze-dried powder of the culture medium supernatant of umbilical cord mesenchymal stem cells cultured in 1640 medium. In the invention, DMSO, fetal bovine serum and umbilical cord between the growth factor as cryoprotective liquid components of mesenchymal stem cells, through the interaction of components, can effectively protect the cartilage cell cryopreservation, and the recovery after maintain cartilage cell recovery rate and survival rate at a high level, and high proliferation ability of cells. Similar protection was significantly better than that of liquid.

【技术实现步骤摘要】
一种软骨细胞冻存保护液及其应用和软骨细胞冻存方法
本专利技术涉及医学领域，具体的说是涉及一种软骨细胞冻存保护液及其应用和软骨细胞冻存方法。
技术介绍
软骨细胞是在软骨发现的唯一一种细胞。软骨细胞主要作用是生成和维持软骨基质，关节软骨损伤后主要由软骨细胞增殖分化来修复。组织工程技术是最近20年新起的一门科学，在软骨缺损修复方面有很多成功的报道。其中软骨细胞的保存是组织工程技术中重要的环节，软骨细胞的增殖能力极有限，其冻存后的质与量直接影响修复作用。目前的软骨细胞冻存保护液，要么成分复杂，配制麻烦，要么冻存效果不理想。现在较为简单的冻存液配方主要有两类：1、DMSO+血清；2、完全培养基+DMSO+血清，而其他类型的冻存保护液多为在此两种配方的基础上添加其他保护细胞的物质，但是这些保护液的冻存效果并不满意。中国专利CN105850979A公开了一种骨髓间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法，其采用DMSO+胎牛血清+骨髓间充质干细胞条件培养基组我诶冻存保护液进行保护，能够使骨髓间充质干细胞冻存复苏后细胞回收率和活力较高。然而，将该专利的冻存液应用于软骨细胞的冻存中发现，软骨细胞的回收率和存活率明显较差。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种软骨细胞冻存保护液，使得所述冻存保护液能够显著提高入骨细胞冻存复苏后的细胞回收率、细胞存活率和细胞增殖能力，同时基于该冻存保护液本专利技术提供了一种软骨细胞的冻存方法。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种软骨细胞冻存保护液，包括DMSO、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子；做为优选，所述冻存保护液由DMSO、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子；所述脐带间充质干细胞生长因子为脐带间充质干细胞经1640培养基培养后的培养基上清液冻干粉。针对现有软骨细胞冻存保护液保护效果不理想的问题，本专利技术将DMSO、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子作为保护液的有效成分，通过各组分的共同作用，实现了软骨细胞冻存复苏后细胞活率和回收率保持在较高水平的目的，同时提高了细胞增殖能力。作为优选，所述冻存保护液中DMSO和胎牛血清的体积比为(1-2):(8-9)；在具体实施方式中，所述冻存保护液中DMSO和胎牛血清的体积比为1:9或1:4，两者上述配比均可以转换成任何形式，只要符合比例即可。作为优选，所述冻存保护液中脐带间充质干细胞生长因子的浓度为1-2mg/mL。本专利技术在具体实施方式中还提供了所述脐带间充质干细胞生长因子由具体制备方法，如下：取P1-P5代的脐带间充质干细胞扩繁，用低糖DMEM+10％FBS培养细胞，3天一换液，至细胞生长融合度达80％以上时，换用1640培养基培养，每天收集培养细胞的培养基，连续收集三天，通过滤膜过滤浓缩同时除去颗粒物质，滤液浓缩至蛋白质浓度为1000mg/L时冻干，获得生长因子。更为具体地，取P1-P5代的脐带间充质干细胞，用低糖DMEM+10％FBS进行大规模培养，接种于培养皿或培养瓶中，接种密度1-10×105cell/mL；3天一换液，当细胞生长融合度达80％以上时，以PBS清洗细胞两遍，换用1640培养基继续培养细胞，每天收集培养细胞的培养基，连续收集三天，先经0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质，滤液再经0.22μm滤膜过滤浓缩并除去3KDa以下小颗粒物质，滤液浓缩至蛋白质浓度为1000mg/L时冻干，获得生长因子。以不同冻存保护液对相同来源的软骨细胞进行冻存试验，待复苏后统计各处理组软骨细胞的回收率和存活率，结果显示，本专利技术冻存保护液能够显著提高软骨细胞的回收率和存活率，优于其他各对照处理组，这其中也包括现有专利CN105850979A冻存保护液。基于上述有益效果，本专利技术提供了所述冻存保护液在冻存软骨细胞以及制备软骨细胞冻存保护产品中的应用。此外，本专利技术还提供了一种冻存软骨细胞的方法，将需冻存的软骨细胞按常规方法消化离心后，加入胎牛血清，调整细胞密度至(0.1-10)×106个/mL加入等体积的本专利技术所述冻存保护液，混匀后，分装至冻存管中，置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中1到5天，转移至液氮中长久保存。在具体实施方式中，上述方法可以具体为：将需冻存的软骨细胞加0.015mL/cm2的0.25％的胰酶和0.04％EDTA消化2min，用10倍于消化液的含胎牛血清的低糖DMEM培养基终止酶解，取样计数，200g离心5min去上清，用胎牛血清重悬细胞沉淀至细胞密度为4×106个/mL，轻轻吹打均匀后，加入等体积的本专利技术所述冻存保护液，混匀后，分装至冻存管中，置于程序降温盒中，程序降温盒置于-80℃中1到5天，转移至液氮中长久保存。由以上技术方案可知，本专利技术以DMSO、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子作为冻存保护液的组分，通过各组分的相互作用，可有效保护软骨细胞冻存，并在复苏后维持软骨细胞回收率和存活率在较高水平，同时提高细胞增殖能力，显著优于同类保护液。附图说明图1所示为不同冻存保护液处理后的软骨细胞生长曲线。具体实施方式本专利技术实施例公开了一种软骨细胞冻存保护液及其应用和软骨细胞冻存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术内。本专利技术产品和应用已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。以下就本专利技术所提供的一种软骨细胞冻存保护液及其应用和软骨细胞冻存方法做进一步说明。实施例1：脐带间充质干细胞生长因子的制备取P1-P5代的脐带间充质干细胞，用低糖DMEM+10％FBS进行大规模培养，接种于培养皿或培养瓶中，接种密度1-10×105cell/mL；当细胞生长融合度达80％以上时，收集细胞并以PBS清洗细胞两遍，换用1640培养基继续培养细胞，3天一换液，至细胞生长融合度达80％以上时，收集培养细胞的培养基，先经0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质，滤液再经0.22μm滤膜过滤浓缩并除去3KDa以下小颗粒物质(浓缩过程采用Slice200切向流器，循环过滤的时间为3h)，滤液浓缩至蛋白质浓度为1000mg/L时冻干，获得生长因子。实施例2：本专利技术所述冻存保护液1、配方(1)DMSO、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子，DMSO和胎牛血清的体积比为1:9，脐带间充质干细胞生长因子浓度为1mg/mL；(2)DMSO、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子，DMSO和胎牛血清的体积比为1:4，脐带间充质干细胞生长因子浓度为2mg/mL；2、配制方法按配方中比例，用胎牛血清将干细胞生长因子溶解并混合均匀，再加入DMSO，后置于冰水浴中至冻存液温度将近于0摄氏度。实施例3：软骨细胞冻存复苏试验1、冻存液分组A组：实施例2配方1冻存保护液；B组：DMSO+FBS，两者体积比1:4；C组：DMSO+FBS+低糖DMEM(含10％FBS)，三者体积比1:2:2；D组：专利CN105850979A实施例2冻存保护液；E组：DMSO+FBS+脐带间充质干细胞条件培养基，三者体积比为1:4:5，脐带间充质干细胞条件培养基按照专利CN1058509本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种软骨细胞冻存保护液，其特征在于，包括DMSO、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子；所述脐带间充质干细胞生长因子为脐带间充质干细胞经1640培养基培养后的培养基上清液冻干粉。

【技术特征摘要】
1.一种软骨细胞冻存保护液，其特征在于，包括DMSO、胎牛血清和脐带间充质干细胞生长因子；所述脐带间充质干细胞生长因子为脐带间充质干细胞经1640培养基培养后的培养基上清液冻干粉。2.根据权利要求1所述冻存保护液，其特征在于，所述冻存保护液中DMSO和胎牛血清的体积比为(1-2):(8-9)。3.根据权利要求2所述冻存保护液，其特征在于，所述冻存保护液中DMSO和胎牛血清的体积比为1:9或1:4。4.根据权利要求1所述冻存保护液，其特征在于，所述冻存保护液中脐带间充质干细胞生长因子的浓度为1-2mg/mL。5.根据权利要求1所述冻存保护液，其特征在于，所述脐带间充质干细胞生长因子由以下方法制备获得：取P1-P5代的脐带间充质干细胞扩繁，用低糖DMEM+10％FBS培养细胞，3天一换液，至细胞生长融合度达80％以上时，换用1640培养基培养，每天收集培养细胞的培养基，连续收集三天，通过滤膜过滤浓缩同时除去颗粒物质，滤液浓缩至蛋白质浓度为1000mg/L时冻干，获得生长因子。6.根据权利要求5所述冻存保护液，其特征在于，所述脐带间充质干细胞生长因子由以下方法制备获得：取P1-P5代的脐带间充质干细胞，用低糖DMEM+10％FBS进行大规模培养，接种于培养皿或培养瓶中，接种密度1-10×105cell/mL；3天一...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，葛啸虎，王一飞，梁美乐，王小燕，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44