一种桔青霉核酸酶P1菌种选育筛选方法技术

为从紫外诱变条件下得到的大量突变株中快速筛选桔青霉核酸酶P1高产株，采用TB‑RNA平板筛选方法，并考察多种因素对TB‑RNA平板上桔青霉核酸酶P1粉红酶解圈形成的影响，优化筛选配方，得到优化反应条件为：超滤水体系，甲苯胺蓝浓度2×10

Screening and screening method of Penicillium nuclease P1 strain

In order to get from UV irradiation under the condition of a large number of mutants in rapid screening of high yield strain of Penicillium citrinum nuclease P1, using TB RNA plate screening method, and the effects of various factors on the effect of TB RNA tablet on Penicillium citrinum nuclease enzyme P1 pink circle formed by the optimized formula, obtained the optimum reaction conditions were: ultrafiltration water system, the concentration of 2 * 10 toluidine blue

【技术实现步骤摘要】
一种桔青霉核酸酶P1菌种选育筛选方法
本专利技术提供一种菌种选育筛选方法，具体为桔青霉核酸酶P1菌种选育筛选方法。
技术介绍
核酸是生命之源，核苷酸作为核酸的基本组成单元，是参与新陈代谢不可缺少的物质(米夫定、三磷酸胞苷二钠等)的原料，还经常被添加到食品、保健品和饲料中，目前市场上销售的天露液、康甘泰、珍奥核酸、生科核苷酸系列保健品中都含有核苷酸。核酸酶在一定的pH、温度和底物浓度下，能高效、专一的作用于RNA或DNA单链中3'-碳原子上的羟基与磷酸形成的磷酸二酯键得到5′-核苷酸。其产生的5′-核苷酸具有很好的营养保健作用，其中5′-GMP和5′-AMP也是一种天然的风味增强剂，能够明显地优化或提高产品的风味特性。并且5′-AMP还可以在腺苷脱氨酶的作用下转化为协同风味增强效果更好的5′-IMP。该酶在水解过程中具有水解效率高、副产物少的优点。早在1913年日本化学家小玉新太郎便分析出鱼干里的鲜味成分是一种核苷酸的钠盐。20世纪50年代，日本即开始出现以核苷酸盐类为主要成分的助鲜剂。后来发现助鲜核苷酸和早已广泛使用的味精相配合可以大大提高鲜味，于是在日本出现了所谓“强力味精”，并迅速进入国际市场。随着核苷酸类助鲜剂的大量生产和核苷酸用途的不断扩大，产品先后应用于食品、医药产品和保健品中。到20世纪70年代中期，仅用做助鲜剂的核苷酸年产量已超过3000t。当前日本的核酸类物质的总产量已经超过5000t，产品种类已经达到上百种，由于主要用作生产抗病毒和抗癌药物的原料，产值也大大提高。日本创立核酸产业后，在20世纪60年代已经受到美国的重视，并有人开始研究核苷酸的应用。1972年另一些美国科学家开始研制称为阿谱林津(注射剂)和欧拉金(口服剂)的核酸类药物，被认为是第二代的干扰素诱生剂，目前在FDA指导下进入3期临床试验。这两种以核酸类物质为原料的核酸药物的研制，有英国、德国、加拿大等多个国家的研究所和大学参与。但大多数菌种产酶活力低、专一性不强，在很大程度上制约了核苷酸工业的发展。1964年我国研究用桔青霉生产核酸酶P1的方法。此后，通过诱变育种等方法提高产酶量的研究进行得比较多。应用此方法使桔青霉的产酶活力大大提高，为以后的研究奠定了基础，并最终达到了工业化生产的目的。以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种，具有速度快、收效大、方法简单等优点，迄今为止，国内外发酵工业中所使用的生产菌种绝大部分是由人工诱变选育出来的，提高酶产量和质量直接影响了企业的利润，因而，培育高产稳定的核酸酶生产菌株对于核酸酶生产企业具有重要的经济价值。在核酸酶P1研究中通过诱变育种等方法来提高产酶量的研究进行的比较多，但是怎么快速并大量的筛选诱变后的高产菌株是关键。我们通过查阅大量资料，采用TB-RNA平板进行筛选，并进行优化实验，完善其筛选的准确性，通过后期发酵验证，确定其可行性。如今大多数桔青霉菌种产酶活力低，专一性不强，在很大程度上制约了核苷酸工业的发展。现要提高生产菌株的酶产量，培育出高产且稳定的核酸酶生产菌株对于核酸酶生产企业具有重要的经济价值，我们通过对生产菌株进行紫外诱变的手段，优化一种高效、稳定的筛选方法对诱变后的菌株进行高通量的筛选，从而得到我们所期望的高产菌株。
技术实现思路
核酸酶作用机理核酸酶在一定的pH、温度和底物浓度下，能高效、专一的作用于RNA或DNA单链中3'-碳原子上的羟基与磷酸形成的磷酸二酯键得到5′-核苷酸。其产生的5′-核苷酸具有很好的营养保健作用，其中5′-AMP和5′-GMP也是一种天然的风味增强剂，能够明显的改善或提高产品的风味特性。并且5′-AMP还可以在腺苷脱氨酶的作用下转化为协同风味增强效果更好的5′-IMP。该酶在水解过程中具有水解效率高、副产物少的优点。TB-RNA平板筛选原理TB-RNA平板的筛选原理是在PDA培养基中加入RNA和染色剂甲苯胺蓝后，平板显示出蓝色，通过稀释涂布法将诱变后菌株均匀地涂在平板上，在29℃恒温培养箱内反应3d后，由于桔青霉产生的核酸酶菌株周围的RNA反应完，使之周围显示出独特的粉红色酶解圈，而且酶解圈大小与酶活呈正相关关系。用此方法用于核酸酶P1高产菌株的高效筛选。本专利技术提供一种桔青霉核酸酶P1菌种选育筛选方法，包括如下步骤：(1)取RNA用缓冲液进行溶解，沸水浴中水浴使RNA变性；(2)以缓冲液配制2w/v％琼脂粉，加热融化，冷却到55℃之后加入变性的RNA混合均匀，再加入甲苯胺兰溶液，混合均匀倒平板，待凝制得TB-RNA平板；(3)取牛津杯放在凝固的TB-RNA表面，取酶液加入牛津杯内，然后25-30℃(优选为28℃)培养箱中放置12h，测量酶解圈直径，核酸酶P1的酶活大小与粉红色酶解圈直径大小具有正相关关系，以酶解圈与菌落的直径比大于1.71为指标，即可完成桔青霉核酸酶P1菌种选育筛选。所述的缓冲液pH7.0磷酸缓冲体系、pH5.8的超滤水体系以及pH5.1醋酸缓冲体系，优选为pH5.8的超滤水体系。所述的甲苯胺兰溶液的浓度为3×10-4mol/L～2×10-4mol/L，优选为浓度为2×10-4mol/L。所述的RNA底物浓度为0.075w/v％～0.125w/v％，优选浓度为0.1w/v％。所述的酶液为桔青霉产生的酶活的核酸酶P1通过稀释后酶活性在50～500U/mL之间的核酸酶P1稀释液，优选浓度为200-400U/mL。所述的酶液的培养包括如下步骤：(1)培养基马铃薯葡萄糖液体培养基：土豆切碎，沸水中煮呈糊状，过滤，加入葡萄糖，琼脂粉，搅拌均匀，制得PDA培养基，再加入0.1％RNA和2×10-4mol/l甲苯胺兰，121℃灭菌30min，即为培养基马铃薯葡萄糖液体培养基；(2)种子培养：将原始菌种转接到活化培养基平板，于28℃恒温培养，培养3d后将孢子转接到另一块平板，29℃恒温培养3d后转接至试管斜面，29℃恒温培养3d；(3)摇瓶培养：将活化好的菌种接入装有发酵培养基的瓶中，于29℃、200r/min摇床培养20-28h，收集发酵液并过滤，得到酶液。TB-RNA平板的优化TB-RNA平板的建立符合并合适用于核酸酶菌种诱变及筛选工作，它有独特的显色方式，在优化试验过程中，在优化反应条件(水体系，甲苯胺蓝浓度2×10-4mol/L，及RNA加入浓度0.1％)下，所形成的粉红色酶解圈大小与菌株酶活高低呈正相关关系，使反应更加明显。初筛结果通过在紫外诱变试验中，在紫外灯功率为15w，照射距离为30cm下，以诱变时间分类进行紫外灯照射，紫外诱变后的菌株进行TB-RNA平板进行初筛，共得到116株明显诱变桔青霉菌株，我们通过比对各诱变菌株的直径比及菌落形态，和菌株镜检图，共选择出36株诱变菌株进行下一批的复筛。复筛结果筛选后通过后期的发酵验证，得到了较好的实验结果，在出发菌株酶活在300U/ml下得到了酶活为369.5U/ml的诱变菌株，酶活量最高提高了23％。在这良好的实验结果下，可以进行下一步的茄瓶培养及发酵验证来验证此诱变菌株酶活是否稳定。本专利技术以优化反应条件为：超滤水体系，甲苯胺蓝浓度2×10-4mol/L，及RNA加入浓度0.1％，以优化配方在28℃恒温培养箱中反应12h，从培养皿中会发现核酸酶的酶活大小与粉红色酶解圈直径大小本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种桔青霉核酸酶P1菌种选育筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）取RNA用缓冲液进行溶解，沸水浴中水浴使RNA变性；（2）以缓冲液配制2w/v%琼脂粉，加热融化，冷却到55℃之后加入变性的RNA混合均匀，再加入甲苯胺兰溶液，混合均匀倒平板，待凝制得TB‑RNA平板；（3）取牛津杯放在凝固的TB‑RNA表面，取酶液加入牛津杯内，然后25‑30℃培养箱中放置12h，测量酶解圈直径，核酸酶P1的酶活大小与粉红色酶解圈直径大小具有正相关关系，以酶解圈与菌落的直径比大于1.71为指标，即可完成桔青霉核酸酶P1菌种选育筛选。

【技术特征摘要】
1.一种桔青霉核酸酶P1菌种选育筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）取RNA用缓冲液进行溶解，沸水浴中水浴使RNA变性；（2）以缓冲液配制2w/v%琼脂粉，加热融化，冷却到55℃之后加入变性的RNA混合均匀，再加入甲苯胺兰溶液，混合均匀倒平板，待凝制得TB-RNA平板；（3）取牛津杯放在凝固的TB-RNA表面，取酶液加入牛津杯内，然后25-30℃培养箱中放置12h，测量酶解圈直径，核酸酶P1的酶活大小与粉红色酶解圈直径大小具有正相关关系，以酶解圈与菌落的直径比大于1.71为指标，即可完成桔青霉核酸酶P1菌种选育筛选。2.根据权利要求1所述的桔青霉核酸酶P1菌种选育筛选方法，其特征在于，所述的缓冲液pH7.0磷酸缓冲体系、pH5.8的超滤水体系以及pH5.1醋酸缓冲体系，优选为pH5.8的超滤水体系。3.根据权利要求1所述的桔青霉核酸酶P1菌种选育筛选方法，其特征在于，所述的甲苯胺兰溶液的浓度为3×10-4mol/L~1.5×10-4mol/L，优选为浓度为2×10-4mol/L。4.根据权利要求1所述的青霉核酸酶P1菌种选育筛选方法，其特征在于，所述的RNA底物浓度为0.075w/v%~0.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑美娟，龚大春，余华顺，姚鹃，吕育财，郭金玲，雷生姣，田毅红，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42