一种黄胸散白蚁唾液腺β‑糖苷酶基因的克隆及原核表达方法技术

本发明专利技术公开了一种黄胸散白蚁唾液腺β‑糖苷酶基因的克隆及原核表达方法。本发明专利技术通过NCBI上提供的其他白蚁种唾液腺β‑糖苷酶蛋白质序列设计简并PCR序列，扩增得到目的基因的部分片段，再通过3′及5′RACE法获得黄胸散白蚁唾液腺β‑糖苷酶基因的全长cDNA序列；cDNA序列长为1691bp，开放阅读框大小为1488bp，蛋白质序列具有典型的糖基水解酶I家族保守结构域，与北美散白蚁唾液腺β‑糖苷酶氨基酸序列具有95％的一致性。在此基础上，扩增该基因开放阅读框架序列，构建表达质粒pET32a‑GZRfbg1，后转入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)以及BL21中，使用IPTG进行诱导表达，最后在Rosetta 2(DE3)细胞中成功融合表达出β‑糖苷酶蛋白。本发明专利技术方法可用于白蚁酶资源开发以及未来白蚁仿生消化系统的构建，具有良好的应用价值。

A clone of Reticulitermes speratus salivary gland beta glycosidase gene and prokaryotic expression method

The invention discloses a method and prokaryotic expression of Reticulitermes speratus salivary gland beta glycosidase gene cloning. The present invention provides NCBI through the other salivary glands of termites beta glucosidase protein sequence design of degenerate PCR sequence, amplified fragment of target gene, the full-length cDNA sequence of 3 'and 5' RACE method Reticulitermes speratus salivary gland beta glycosidase gene; cDNA sequence length is 1691bp. An open reading frame of 1488bp and protein sequences have typical I glycosyl hydrolase family conserved domain, consistent with North American Reticulitermes salivary gland beta glucosidase has 95% amino acid sequence. On this basis, amplified the gene sequence of open reading frame, constructing the expression plasmid pET32a GZRfbg1, then transformed into Escherichia coli Rosetta 2 (DE3) and BL21, IPTG expression was induced at Rosetta, 2 (DE3) cells successfully expressed fusion protein beta glucosidase. The method can be used for the exploitation of termite enzyme resources and the construction of the bionic digestive system of termites in the future, and has good application value.

【技术实现步骤摘要】
一种黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶基因的克隆及原核表达方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶基因的克隆及原核表达方法。
技术介绍
木质纤维素是地球生态系统中最为丰富的可再生资源，其生物学转化是新能源开发的新领域。黄胸散白蚁(食木)是我国南方最重要的白蚁种群之一，其体内的木质纤维素酶系统对木质纤维素的降解效率高达97％以上，该系统被认为是21世纪最有前途的生物反应器。白蚁纤维素酶可由自身唾液腺、中肠以及后肠的微生物分泌，主要包括：内切葡聚糖酶、β-糖苷酶以及外切葡聚糖酶。到目前为止，由于白蚁未有完整的全基因组序列，因此对于白蚁自身纤维素酶基因的获取，主要依靠文库筛选、蛋白质纯化反向测序以及简并PCR结合cDNA末端扩增技术。其中简并PCR结合cDNA末端技术是最为快速、便捷获取全长cDNA序列的方法。白蚁自身纤维素基因的表达已经在大肠杆菌、真菌、昆虫表达系统中有所研究，其中大肠杆菌原核表达系统是蛋白表达研究最为高效经济的研究手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：首次提供一种黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶基因的克隆及原核表达方法。为了实现本专利技术上述目的，本专利技术提供了一种黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶基因(GZRfbg1)，其cDNA序列由1691个碱基对组成，开放阅读框大小为1488bp，转录起始密码子ATG位于第45～47个碱基，终止密码子TAA位于第1530～1532，在3′端具有poly-adenylation信号序列AATAAA以及poly(A+)尾部特征序列，如SEQIDNO:1所示。本专利技术还提供了一种黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶GZRfBG1蛋白，其由所述的黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶基因(GZRfbg1)的开放阅读框编码448个氨基酸，蛋白大小为56.45kDa，信号肽剪切位点位于第17与第18个氨基酸之间，具有典型的糖基水解酶I家族保守结构域。本专利技术上述黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶基因(GZRfbg1)cDNA序列的获取方法包括如下步骤：用黄胸散白蚁提取总RNA，通过NCBI上提供的其他白蚁种唾液腺β-糖苷酶蛋白质序列设计简并PCR序列，扩增得到所述黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶基因(GZRfbg1)的部分片段，再通过3′及5′RACE法获得全长cDNA序列；其中，所述简并PCR序列如SEQIDNO:2～11所示；所述RACE法中使用的引物如SEQIDNO:12～22所示。本专利技术还提供了一种基于大肠杆菌表达系统的重组GZRfBG1蛋白的制备方法，其包括如下步骤：(1)基因开放阅读框序列扩增：根据所述黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶基因(GZRfbg1)的cDNA序列，设计引物去除信号肽序列以及终止密码子，并分别在上游及下游引物中引入NcoI与XhoI限制性酶切酶酶切位点；(2)使用pMD20-T载体连接试剂盒将扩增片段连接pMD20-T质粒，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组扩增菌株pMD-20T-GZRfbg1-DH5α；(3)分别将重组扩增菌株pMD-20T-GZRfbg1-DH5α与表达质粒pET32a空载体用NcoI与XhoI快切酶双酶切，酶切产物纯化后后用T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组表达质粒扩增菌株pET32a-GZRfbg1-DH5α；(4)将重组表达质粒扩增菌株pET32a-GZRfbg1-DH5α转化大肠杆菌表达菌株Rosetta2(DE3)，得到GZRfBG1表达菌株pET32a-GZRfbg1-Rosetta2(DE3)；(5)将表达菌株pET32a-GZRfbg1-Rosetta2(DE3)，1％接种LB培养基，在25℃条件下、220r/min摇床培养至OD600为0.4～0.5，使用终浓度为0.1mmol/LIPTG，继续在20℃诱导培养18小时后，在4℃、8000×g条件下离心5min，收取细胞沉淀；(6)将细胞沉淀用50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)重新悬浮，加入终浓度为5mmol/LEDTA和1mmol/lPMSF，吹打均匀，再在冰浴条件下进行超声波裂解，振幅50％，工作3s停5s，持续20min；然后将细胞在4℃、8000×g条件下离心20min，得到上清为可溶性GZRfBG1蛋白，沉淀为包涵体状态的GZRfBG1蛋白。其中，所述上游引物序列如SEQIDNO:23所示，酶切位点为CCATGG；所述下游引物序列如SEQIDNO:24所示，酶切位点为CTCGAG。相对于现有技术，本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术采用简并PCR结合RACE的方法第一次从黄胸散白蚁克隆出的唾液腺β-糖苷酶基因的cDNA全长序列，通过与pET32a连接构建重组表达质粒，选择大肠杆菌Rosetta2(DE3)作为重组蛋白生产细胞，克服了在原核表达系统中表达真核来源蛋白的密码子偏好性。本专利技术为白蚁酶资源开发以及未来白蚁仿生消化系统构建补充了重要的理论基础，具有良好的应用价值。附图说明图1是黄胸散白蚁总RNA凝胶电泳鉴定图，其中，泳道M为DNAMarker(DL2000)，1和2泳道为总RNA提取物。图2是黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶基因GZRfbg1的简并PCR图，其中泳道M为DNAMarker(DL2000)，1～5泳道为不同简并引物组合后GZRfbg1基因片段扩增产物。图3是重组质粒pET32a-GZRfbg1酶切鉴定结果图，其中M为DNAMarker(Marker4)；泳道1、3为重组表达载体pET32a-GZRfbg1用NcoI与XhoI双酶切阳性鉴定结果。图4是GZRfbg1ORF编码的蛋白质氨基酸序列在NCBI上的同源比对结果。保守氨基酸分为三个层次标识，其中黑色，深灰以及灰色分别表示100％，80％以及60％的保守性。图5是黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶在大肠杆菌中融合表达的SDS-PAGE及western-blot鉴定图，其中，A为SDS-PAGE结果，其中泳道M为蛋白(invitrogen公司)，泳道1为空载体pET32a在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中表达的细胞全蛋白样品，泳道2为GZRfBG1在大肠杆菌BL21中表达的细胞全蛋白样品，泳道3为GZRfBG1在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中表达的细胞全蛋白样品，泳道4为GZRfBG1在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中表达的细胞裂解上清蛋白样品，泳道5为纯化后的GZRfBG1融合表达蛋白；B为western-blot结果，其中泳道M为蛋白(invitrogen公司)，泳道1为pET32a空载体在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中表达的蛋白样品；泳道2为GZRfBG1在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中表达的细胞裂解后沉淀蛋白样品；泳道3为GZRfBG1在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中表达的细胞裂解上清蛋白样品，泳道4为纯化后的GZRfBG1融合表达蛋白。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本专利技术，并非为了限定本专利技术，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例11)总RNA的提取及总cD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄胸散白蚁唾液腺β‑糖苷酶基因(GZRfbg1)，其特征在于，其cDNA序列由1691个碱基对组成，开放阅读框大小为1488bp，转录起始密码子ATG位于第45～47个碱基，终止密码子TAA位于第1530～1532，在3′端具有poly‑adenylation信号序列AATAAA以及poly(A+)尾部特征序列，如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶基因(GZRfbg1)，其特征在于，其cDNA序列由1691个碱基对组成，开放阅读框大小为1488bp，转录起始密码子ATG位于第45～47个碱基，终止密码子TAA位于第1530～1532，在3′端具有poly-adenylation信号序列AATAAA以及poly(A+)尾部特征序列，如SEQIDNO:1所示。2.一种黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶GZRfBG1蛋白，其特征在于，由权利要求1所述的黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶基因(GZRfbg1)的开放阅读框编码448个氨基酸，蛋白大小为56.45kDa，信号肽剪切位点位于第17与第18个氨基酸之间，具有典型的糖基水解酶I家族保守结构域。3.权利要求1所述的黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶基因(GZRfbg1)cDNA序列的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：用黄胸散白蚁提取总RNA，通过NCBI上提供的其他白蚁种唾液腺β-糖苷酶蛋白质序列设计简并PCR序列，扩增得到所述黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶基因(GZRfbg1)的部分片段，再通过3′及5′RACE法获得全长cDNA序列；其中，所述简并PCR序列如SEQIDNO:2～11所示；所述RACE法中使用的引物如SEQIDNO:12～22所示。4.一种基于大肠杆菌表达系统的重组GZRfBG1蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)基因开放阅读框序列扩增：根据所述黄胸散白蚁唾液腺β-糖苷酶基因(GZRfbg1)的cDNA序列，设计引物去除信号肽序列以及终止密码子，并分别在上游及下游引物中引入NcoI与XhoI限制性酶切酶酶切位点；(2)使用pMD20-T载体连接试剂盒将扩增片段连接p...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾文慧，钟俊鸿，李秋剑，刘炳荣，胡少芳，
申请(专利权)人：广东省生物资源应用研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44