一种重组纤维结构胶原蛋白海绵的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种重组纤维结构胶原蛋白海绵及其制备方法，该胶原蛋白海绵具有重组纤维结构，整体结构呈海绵状，胶原蛋白海绵表面具有胶原的微纤维结构，其胶原分子以纤维形式存在，且具有三维螺旋结构。其制备方法主要包括：利用切向流过滤技工艺进行胶原蛋白的纯化及浓缩；在体外进行分子自组装；离心分离；凝胶化；反复预冻、解冻及水洗；冷冻干燥。本发明专利技术的制备方法产能高、工艺稳定，制得的重组纤维结构胶原蛋白海绵可广泛应用于创伤、外科手术创口的止血和修复，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种重组纤维结构胶原蛋白海绵的制备方法
本专利技术属于生物医用材料
，尤其涉及一种重组纤维结构胶原蛋白海绵的制备方法。
技术介绍
I型胶原是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，在肌腱和韧带、皮肤、血管、角膜、骨等组织中都有分布。胶原通过其独特的结构来实现不同组织中对力学特性的不同要求，起着稳定、支撑，提供强度的作用。I型胶原纤维可溶于酸溶液中，当pH和温度升髙至一定程度时，会在体外重组形成纤维。胶原是一种特殊可生物降解的材料，人体内的胶原酶能使胶原降解为各种片段，在体温下这些大片段很快自发变性，被其他酶进一步降解成寡肽或氨基酸。或者被结缔组织细胞核炎症细胞吞噬，并由溶酶体将其进一步降解。胶原蛋白海绵与血液接触，利用其海绵结构的毛细作用，迅速吸附血液，引起血小板聚集，破坏血小板，激活内源性凝血因子，产生凝血酶，凝血酶再催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，使血液凝固。现有纯胶原蛋白海绵在应用过程中往往降解快、力学性能差，机械强度低，并且海绵在湿润环境下很难维持自身固有形态，容易坍塌。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题在于：提供一种胶原蛋白海绵，克服了传统胶原蛋白海绵只能利用海绵结构吸收血液中的水分进行物理止血，止血效果欠佳的问题，以实现微纤维显微结构进行生物止血的功能。本专利技术解决的又一技术问题在于：提供胶原蛋白海绵的制备方法，克服了现有制备方法透析技术耗时长、效率低以及制备的胶原蛋白海绵上血效果差等缺点，以高效地制备表面具有微纤维结构的胶原蛋白海绵，能够快速止血。本专利技术的技术方案之一：提供一种重组纤维结构胶原蛋白海绵，具有海绵状，胶原蛋白海绵表面具有胶原的微纤维结构，其胶原分子以纤维形式存在，且具有三维螺旋结构。本专利技术的技术方案之二：提供制备胶原蛋白海绵的方法，包括以下步骤：步骤1，利用切向流过滤技工艺对胶原蛋白的纯化及浓缩；步骤2，纯化浓缩的胶原溶液与一定体积的生物缓冲液进行混合，缓冲液中含有5~20ppm交联剂，且混合时缓冲液的温度为30±0.5℃，调节pH为6.5~8.5，进行分子自组装；步骤3，离心，弃上清液，获得浑浊液；步骤4，凝胶化且进行交联；步骤5，在不同温度下进行反复预冻、解冻及水洗；步骤6，冷冻干燥。优选地，所述胶原分子具体有三螺旋结构，能保留其原有的生物学性能，能够吸引原纤维和粘附血小板，随后发生释放反应，触发血小板凝集，并在其纤维间隙内形成血栓。所述胶原蛋白海绵是利用切向流过滤技工艺进行胶原蛋白的纯化及浓缩；在体外进行分子自组装；离心分离；凝胶化；反复预冻、解冻及水洗；冷冻干燥等工艺方法而制得。本专利技术的胶原蛋白海绵在动物体内2周已逐步降解，4-8周能完全降解，吸水率为自重的60倍以上。优选地，所述步骤1是将盐析后胶原纤维用纯化液进行重溶，使用切向流过滤技术对胶原进行纯化、浓缩，此过程在4~13℃温度下进行。优选地，所述步骤1纯化过程中结合搅拌及纯化液的补给，使得胶原能够顺利的进行纯化。优选地，所述步骤1中，所述盐析后胶原纤维重溶后的浓度为0.5~8mg/mL。优选地，所述步骤1中，纯化时选用改性聚醚砜中空纤维过滤管的截留分子量为50~100KD，最终进行胶原浓缩时选用改性聚醚砜中空纤维过滤管的孔径为0.1~1µm；在2~4h内实现胶原溶液的纯化。作为优选，所述步骤1中，纯化液选用0.01M~0.5M醋酸溶液。所述步骤2中，所述胶原溶液的浓度为1~5mg/mL，pH为2.0~3.5；所述生物缓冲液pH为7.2~7.5；分子自组装于30±0.5℃孵育30~90min。优选地，所述步骤2中，所述胶原溶液的浓度为1~5mg/mL，pH为2.0~3.5。优选地，所述步骤2中，所述生物缓冲液包括如HEPES、PBS、TES等中的至少一种，pH为7.2~7.4。优选地，所述步骤2中，所述交联剂包括甲醛、戊二醛、改性戊二醛、碳化二亚胺中的至少一种。优选地，所述步骤3中，离心速度为6000~12000rpm，20~30℃下离心3~30min。优选地，所述步骤4具体为：将步骤3获得的浑浊液混合均匀后，装入模具中，继续升温至35~37℃，凝胶化30min~90min。优选地，所述步骤5中，具体包括以下工艺：1）-80℃快速冷冻，解冻，水洗；其中解冻是在室温下进行缓慢解冻；2）在不同温度下反复冷冻，解冻，水洗：将水凝胶在-40℃和-20℃再进行冷冻；解冻是在室温下进行缓慢解冻。优选地，所述步骤5中，所述水洗是将水凝胶浸泡在自重2~5倍的4~10℃去离子水中1~3次，清除凝胶内的盐分和对于交联剂。优选地，所述步骤6中，冷冻干燥时间为24h-48h。所述的重组纤维结构胶原蛋白海绵，是由上述的制备方法制成的。本专利技术的技术效果：本专利技术的胶原蛋白海绵表面具有胶原的微纤维结构，能够快速激发血小板，促进血凝速度，从而安全高效止血，此技术克服了传统胶原蛋白海绵只是利用海绵结构吸收血液中的水分，进行物理止血，而不能利用胶原纤维本身的显微结构进行生物止血和缺陷；本专利技术的胶原蛋白海绵具有更佳的机械强度、热稳定性及降解性能，具有更合适的体内降解时间，安全有效。进一步地，本专利技术的制备方法中，（1）本专利技术使用切向流技术替代传统透析工艺对胶原蛋白进行纯化，能在2~4h内实现胶原溶液的纯化，原始透析工艺至少需要3~6d，极大的提高了胶原纯化的速率，此技术克服了胶原纯化时采用传统的透析技术耗时长、效率低等缺点。（2）在体外，通过调节胶原溶液的浓度、pH、离子环境、温度等条件，实现胶原分子重组、凝胶化，并对凝胶进行交联改性，并且通过水洗清除凝胶内的盐分和对于交联剂，最终使用冷冻干燥技术，改善了胶原材料的机械强度、热稳定性及降解性能，获得外观形貌良好，且有较合适的体内降解时间，安全有效的胶原蛋白海绵。本专利技术的制备方法产能高、工艺稳定，制得的重组纤维结构胶原蛋白海绵可广泛应用于创伤、外科手术创口的止血和修复，具有良好的应用前景。附图说明图1是本专利技术实施例所制备的重组纤维结构胶原蛋白海绵放大200倍的扫描电镜图。图2是本专利技术实施例所制备的重组纤维结构胶原蛋白海绵放大1000倍的扫描电镜图。图3是本专利技术实施例所制备的重组纤维结构胶原蛋白海绵的胶原分子重组后的纤维结构的透射电镜图。具体实施例本专利技术提供一种重组纤维结构胶原蛋白海绵，具有海绵状，其胶原分子以纤维形式存在，且具有三维螺旋结构。其中，胶原分子具体有三螺旋结构；能保留其原有的生物学性能，能够吸引原纤维和粘附血小板，随后发生释放反应，触发血小板凝集，并在其纤维间隙内形成血栓；所述胶原蛋白海绵是利用切向流过滤技工艺进行胶原蛋白的纯化及浓缩后进行分子自组装、凝胶化、冷冻干燥而制备而成；所述胶原蛋白海绵在动物体内2周已逐步降解，4-8周能完全降解，吸水率为自重的60倍以上。如图1-3所示本专利技术实施例的胶原蛋白海绵的微观结构。图1表明形成的胶原冻干品具有海绵状，有空隙。图2说明形成的胶原蛋白海绵其显微结构是可以看到胶原分子是以纤维的形式存在。图3则是胶原分子自组装后的透射电镜图片，表明此胶原分子还具有三维螺旋结构，则其具有生物活性。本专利技术重组纤维结构胶原蛋白海绵不仅能够利用海绵结构，而且其纤维结构能够吸引原纤维和粘附血小板，随后发生释放反应，触发血小板凝集，并在其纤维间隙内形成血栓，从而利用胶原纤维本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组纤维结构胶原蛋白海绵，具有重组纤维结构，整体结构呈海绵状，胶原蛋白海绵表面具有胶原的微纤维结构，其胶原分子以纤维形式存在。

【技术特征摘要】
1.一种重组纤维结构胶原蛋白海绵，具有重组纤维结构，整体结构呈海绵状，胶原蛋白海绵表面具有胶原的微纤维结构，其胶原分子以纤维形式存在。2.如1所述的重组纤维结构胶原蛋白海绵，其特征在于：胶原分子具体有三螺旋结构；能保留其原有的生物学性能，能够吸引原纤维和粘附血小板，随后发生释放反应，触发血小板凝集，并在其纤维间隙内形成血栓；所述胶原蛋白海绵是利用切向流过滤技术进行胶原蛋白的纯化及浓缩后进行分子自组装、凝胶化、冷冻干燥而制备而成；所述胶原蛋白海绵在动物体内2周已逐步降解，4-8周能完全降解，吸水率为自重的60倍以上。3.制备如权利要求1~2所述的重组纤维结构胶原蛋白海绵的方法，包括以下步骤：步骤1，利用切向流过滤技术进行胶原蛋白的纯化及浓缩；步骤2，纯化浓缩的胶原溶液与一定体积的生物缓冲液进行混合，缓冲液中含有5~20ppm交联剂，且混合时缓冲液的温度为30±0.5℃，调节pH为6.5~8.5，在体外进行分子自组装；步骤3，离心，弃上清液，获得浑浊液；步骤4，凝胶化；步骤5，在不同温度下进行反复预冻、解冻及水洗；步骤6，冷冻干燥。4.制备如权利要求3所述的制备重组纤维结构胶原蛋白海绵的方法，其特征在于：所述步骤1是将盐析后胶原纤维用纯化液进行重溶，使用切向流过滤技术对胶原进行纯化、浓缩，此过程在4~13℃温度下进行。5.制备如权利要求3所述的制备重组纤维结构胶原蛋白海绵的方法，其特征在于：所述步骤1中，将盐析后胶原纤维用醋酸溶液重溶，所述盐析后胶原纤维重溶后的浓度为0.5~8mg/mL；所述步骤1中，使用切向流过滤技术对胶原进行纯化，纯化液选用0.01M...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏欣苗，陈雪霓，李丽花，谭荣伟，佘振定，
申请(专利权)人：深圳兰度生物材料有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44