基于Ag NCs和G‑四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件制造技术

本发明专利技术公开了一种基于Ag NCs和G‑四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件，构建了dsDNA‑loop‑C6结构为模板合成的纳米银簇，结合分割G4‑四链体结构/NMM两种荧光探针的构建，形成黄色和红色两种颜色的荧光输出，构建了双输出的分子逻辑门，以黄色荧光和红色荧光强度为判断依据，当荧光强度归一化数值大于0.45时，输出为”1”，否则输出为”0”。不同的DNA链的输入会对这两种荧光探针产生不同的影响，会有不同荧光信号的输出。在上述原理的基础上，本发明专利技术构建了2‑to‑1和4‑to‑2的两种编码器、1‑to‑2的解码器、半加器及半减器这五种DNA分子逻辑门，可用来检测不同的DNA序列。

Label free DNA NCs and G Ag molecular devices four chain unit based on /NMM system

The invention discloses a device of DNA molecular marker NCs and G free Ag four chain body /NMM system based on dsDNA is constructed loop C6 structure as template synthesis of nano silver clusters, combined with the construction of four chain structure segmentation G4 /NMM two fluorescence probes, fluorescence output form of yellow and red two the colors of the constructed molecular logic gate, with a yellow fluorescence and red fluorescence intensity as the criterion, when the value of normalized fluorescence intensity is greater than 0.45, the output is \1\, otherwise the output is \0\. Different DNA chains will have different effects on these two fluorescent probes, and different fluorescence signals will be produced. Based on the above principle, the invention constructs 2 to 1 and 4 to 2 two 1 to 2 encoder, decoder, half adder and subtracter, half of the five DNA molecular logic gate can be used to detect different DNA sequences.

【技术实现步骤摘要】
基于AgNCs和G-四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件
本专利技术属于DNA分子计算机
，公开了一种采用荧光手段，基于AgNCs和G-四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件、DNA分子器件的构筑以及该DNA分子器件的用途。
技术介绍
1946年，第一台计算机DNIAC在美国的宾西法尼亚大学开始投入运行，在最近50年的发展迅速，为21世纪人们的生产生活方式产生巨大的影响。虽然计算机的运算速度和存储量在当时成为翘首，但是随着人类对于计算机技术的需求不断提高，传统的晶体硅芯片存在着“摩尔定律”的难题。为了克服此难题，科学家门提出了分子器件的设想。相比于传统的半导体电子器件，分子器件具有很多优势，如尺寸小、设计简单可控、储存量大，反应速度快等。分子器件研究的领域主要包括：分子整流器、分子晶体、分子机器及分子逻辑器件等。其中分子逻辑器件是化学分子与数学逻辑运算相结合起来的新型领域。DNA由四种碱基(A、T、G和C)组合而成，并通过碱基的排列组合存储生物遗传信息。DNA的一个重要特性是DNA链可以通过碱基互补配对作用形成杂合的双链双螺旋结构，而且配对具有高度的特异性，即A只能与T，G只能与C结合。这种特异性作用是DNA可用于构建逻辑器件的基础之一。因为DNA分子能够编码所有生物体的遗传方式，也是数据储存和处理最强大的媒介，然而DNA分子在20世纪很少能够在计算机领域有所体现，主要是因为缺乏方法能够把生物分子转化为器件进而实行逻辑操作。自从20世纪90年代LeonardAdleman开创性的设计出体外DNA分子逻辑实验，首次验证了分子计算机的可行性。由于DNA分子具有特异性高、高并行性和微小性等优点,在海量信息存储和处理过程中,可以高容量保存以及并行操作,具有显著优势，这使得DNA分子逻辑门有可能实现更加优越的未来计算机这一目的，成为科技领域的”新星”。G-四链体，是一种依靠鸟嘌呤连接起来的四链DNA螺旋结构，是通过四个相互连接为一个四角形而构成的，由于富含串联重复的鸟嘌呤碱基(G)，四个鸟嘌呤以分子内氢键的形式形成G-四分体。再堆积成G-四链体。以往的研究认为该结构只能人工合成，但2013年的最新研究发现，"G-四链体"的"四螺旋"DNA也存在于人类基因组中。G-四聚体能与蛋白质、核酸、小肽、氨基酸、有机物及金属离子结合，形成具有特异性识别作用的复合物。G-四链体结构在体内极易形成，分布十分广泛并且具有重要的生物学功能。生物体内相应区域的G-四链体参与到端粒延长、DNA复制、转录及基因重组等重要的生命过程，发挥抗癌、抗病毒及抗肿瘤等作用。研究学者已经在体外检测到G-四链体的存在并制备出其晶体，并把其应用于化学分析检测，尤其是在和染料相结合作为荧光探针的应用最为广泛。其中卟啉类有机小分子对G-四链体DNA具有较高特异性的结合能力，利用钾、铅等阳离子能够诱导富含鸟嘌呤(G碱基)的DNA序列形成稳定的G-四链体结构。其中卟啉类分子NMM能够特异性的插入到G-四链体中，其荧光性能急剧升高。以DNA分子为模板形成的纳米材料具有优良的物理和化学性质及广泛的用途，且合成比较简单，近几年来深受科学家们的青睐。尤其是以DNA为模板的银纳米团簇对于模板序列具有高度的依赖性，此性质促使两者相结合应用比较灵活且用途较广。近十几年科学家们研究较多的是以单链DNA(ssDNA)为模板的银纳米团簇，2010年Wangetal.小组成员采用具有loop-C6的双链DNA为模板检测单碱基突变，以此来检测镰刀型细胞贫血病，此结构形成的纳米银团簇对于DNA序列有很强的依赖性，单个碱基的突变会导致荧光强度的急剧下降。以双链DNA为模板形成的纳米银簇与DNA的其他构型及染料相结合巧妙设计的体系在DNA分子计算机领域应用前景非常好，其能设计出高效灵敏、选择性好，操作简单的逻辑器件，对于DNA分子计算机的发展具有重要的意义。一种完全由DNA碱基构成的逻辑门，选用一种铜离子依赖的DNA核酶，这是由Breaker等首先用SELEX方法发现的。基于这种核酶，可以方便地构建YES门、NOT门等基本的分子逻辑门。主要是通过别构效应物存在下核酶结构的变化来调控其水解酶活性，使之产生或不产生底物水解切割反应，然后用电泳方法可以鉴别水解反应是否发生。基于这一方法也可以实现逻辑门之间的连接，形成较为复杂的逻辑门，如设计的AND(A，NOT(B)，NOT(C))。基于核酶的逻辑门已经引起了研究者的广泛关注，然而这种逻辑门能否成为未来DNA计算机的基础还存在很多关键性问题。例如水解作用需要较长的时间(几分钟到几小时)，逻辑门之间的连接仍然存在一些问题等。前者由于DNA的超级并行计算能力可能在大规模计算时可以容忍，而后者则可能需要引入新的元件。例如最近出现的基于具有连接酶活性的核酶逻辑门。连接酶逻辑门的优势在于可以使下游逻辑门不断输出更长的DNA序列用于构建连续电路，而且连接酶可以为水解酶提供新的底物，从而得以重建电路。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供一种基于AgNCs和G-四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件。本专利技术的再一目的在于：提供上述基于AgNCs和G-四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件的构筑。本专利技术的又一目的在于：提供上述基于AgNCs和G-四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件的应用。本专利技术目的通过下述方案实现：一种基于AgNCs和G-四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件，基于镰刀型细胞贫血症的致病基因为基础设计的核酸链，构建了dsDNA-loop-C6结构为模板合成的纳米银簇，结合分割G4-四链体结构/NMM两种荧光探针的构建，形成黄色和红色两种颜色的荧光输出，构建了双输出的分子逻辑门，以黄色荧光和红色荧光强度为判断依据，当荧光强度归一化数值大于0.45时，输出为”1”，否则输出为”0”。本专利技术分子器件具有高效灵敏、简单、选择性好和灵活应用的特点。不同类型DNA链的输入对于上述两种荧光探针产生的影响不同，从而造成荧光信号输出强度发生很大的变化，依此原理可制成不同类型的DNA分子器件。基于AgNCs和G-四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件构筑，属于分子计算机
此体系主要是利用DNA链的置换反应导致DNA构型的变化，来构建两种荧光探针的输出—以双链DNA为模板的AgNCs和G-四链体/NMM。本专利技术原理是，AgNCs是基于DNA碱基互补形成双链，在双链DNA（dsDNA）中存在loop-C6，此结构能很好的结合Ag+，在加入强还原剂NaBH4时能够形成荧光性能很好的纳米银簇，当特定序列的dsDNA结构被破坏时，loop-C6消失，此纳米银簇无法形成，荧光强度急剧下降；而DNA-G4/NMM是基于两条含有TGGGTGGG片段的DNA链互补时拉近两个片段TGGGTGGG之间的距离，在K+存在时易形成G-四链体结构，当加入NMM时能够形成DNA-G4/NMM的稳定结构，此结构能够发射很强的荧光。在上述方案基础上，所述的分子逻辑门包括：2-to-1编码器、4-to-2编码器、1-to-2解码器、半加器和半减器五种DNA分子器件。本专利技术提供一种基于AgNCs和G-四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件的构筑，基于双链DNA形本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于Ag NCs和G‑四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件，其特征在于：基于镰刀型细胞贫血症的致病基因为基础设计的核酸链，构建了dsDNA‑loop‑C6结构为模板合成的纳米银簇，结合分割G4‑四链体结构/NMM两种荧光探针的构建，形成黄色和红色两种颜色的荧光输出，构建了双输出的分子逻辑门，以黄色荧光和红色荧光强度为判断依据，当荧光强度归一化数值大于0.45时，输出为”1”，否则输出为”0”。

【技术特征摘要】
1.一种基于AgNCs和G-四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件，其特征在于：基于镰刀型细胞贫血症的致病基因为基础设计的核酸链，构建了dsDNA-loop-C6结构为模板合成的纳米银簇，结合分割G4-四链体结构/NMM两种荧光探针的构建，形成黄色和红色两种颜色的荧光输出，构建了双输出的分子逻辑门，以黄色荧光和红色荧光强度为判断依据，当荧光强度归一化数值大于0.45时，输出为”1”，否则输出为”0”。2.根据权利要求1所述的基于AgNCs和G-四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件，其特征在于，所述的分子逻辑门包括：2-to-1编码器、4-to-2编码器、1-to-2解码器、半加器和半减器五种DNA分子器件。3.根据权利要求1或2所述的基于AgNCs和G-四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件的构筑，其特征在于，基于双链DNA形成loop-C6构型为模板的纳米银簇和两段DNA片段TGGGTGGG相互靠近时在K+溶液体系作用下形成G-四链体结构，加入荧光染料NMM插入到此G-四链体结构中，形成两种荧光探针体系；在DNA链置换自组装时会发生两种探针的荧光的升高与猝灭，构筑成分子逻辑门。4.根据权利3要求所述的基于AgNCs和G-四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件的构筑，其特征在于，2-to-1编码器的构筑按下述步骤：（1）以单链P-DNA为基础，P-DNA碱基序列为：5’-CTTCTCCACACCCCCCGGAGTCAGGTGCAC-3’，P-DNA中存在CCCCCC；当输入其互补链P1-DNA时，P1-DNA碱基序列为：5’-GTGCACCTGACTCCTGTGGAGAAG-3’，P/P1能很好的互补，并且在此双链中会形成dsDNA/loop-C6结构，此dsDNA/loop-C6结构作为形成纳米银簇的模板；加入AgNO3和NaBH4时，P/P1体系能形成纳米银簇，形成激发光在520nm，发射峰为570nm处荧光，黄色荧光，此荧光强度很强，归一化数值大于0.45，输出为1；（2）当输入的是与P-DNA完全不互补的P0-DNA时，P0-DNA的碱基序列为：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’时，无法形成上述的dsDNA/loop-C6结构，加入AgNO3和NaBH4无法形成纳米银簇，无特征荧光的发射；（3）以P1和P0作为输入信号，无特征荧光的发射，纳米银簇的荧光强度作为输出信号构筑了2-to-1的编码器。5.根据权利4要求所述的基于AgNCs和G-四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件的构筑，其特征在于，4-to-2的编码器构筑按下述步骤：（1）以单链HS-DNA为基础，单链HS-DNA的序列为：5’-CTTCTCCACACCCCCCGGAGTCAGGTGCACTTTTTTTGGGTGGG-3’，HS-DNA中存在CCCCCC，在3’端存在形成G-四链体的片段TGGGTGGG；当输入与其互补链P1-DNA时，P1-DNA碱基序列为：5’-GTGCACCTGACTCCTGTGGAGAAG-3’，HS-DNA/P1-DNA能很好的互补，并且在此双链中形成dsDNA/loop-C6结构，当加入AgNO3和NaBH4时，HS/P1体系能形成激发光520nm，发射570nm处形成荧光强度很强的纳米银簇，AgNCs的输出值为1，但是在P1序列中无富G片段，HS/P1体系无法形成G-四链体，NMM的输出值为0；（2）当输入P2-DNA时，P2-DNA的序列为：5’-GGGTGGGTAAAAAAGTGCACCTGACTCCGGGGGGTGTGGAGAAG，由于P2-DNA中间片段存在GGGGGG，能与HS中的CCCCCC完全互补，从而HS/P2体系无法形成loop-C6，加入AgNO3和NaBH4无法形成纳米银簇特征荧光的发射，AgNCs的输出值为0，但是拉进了两个富G序列之间的距离，在K+存在时形成很稳定的G-四链体结构，加入NMM后形成发射波长在615nm的特征荧光，此时该荧光的强度很强，NMM的输出值为1；（3）当输入P3-DNA时，P3-DNA序列为：5’-GGGTGGGTAAAAAAGTGCACCTGACTCCTGTGGAGAAG-3’，HS-DNA与P3-DNA互补形成双链时，在HS/P3体系中即形成了dsDNA/loop-C6结构，P3-DNA的5’端存在形成G-四链体的片段GGGTGGGT，HS-DNA与P3-DNA互补形成双链时TGGGTGGG与GGGTGGGT相互靠近，当有AgNO3/NaBH4和K+\NMM存在时，在K+溶液体系存在时形成很稳定的G-四链体结构，会有AgNCs和NMM很强的双发射荧光，两种荧光的输出值均为1；（4）当加入P0-DNA时，P0-DNA的碱基序列为：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，P0-DNA与HS-DNA完全不互补，既不能形成loop-C6结构，也不能形成G-四链体，两种荧光都很弱，输出值均为0；因此，以P0-DNA、P1-DNA、P2-DNA和P3-DNA，四种DNA链为输入信号，570nm处的AgNCs和615nm处的NMM荧光发射强度为输出值，构筑了4-to-2的编码器。6.根据权利3要求所述的基于AgNCs和G-四链体/NMM体系的免标记DNA分子器件的构筑，其特征在于，1-to-2的解码器的构筑按下述步骤：（1）以P-DNA/StrB1-DNA为基础，其中单链P的序列为：5’-CTTCTCCACACCCCCCGGAGTCAGGTGCAC-3...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕晓艳，胡晓春，魏伊彤，石硕，姚天明，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海,31