一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法技术

一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法，解决现有的产丁醇技术存在底物成本高、产丁醇效率低及副产物含量多的问题。本发明专利技术在产丁醇细菌发酵至对数期时，外添一定浓度的丁酸溶液和缓冲剂，混合均匀后在恒定温度的条件下继续振荡培养，得到富含丁醇的发酵液。本发明专利技术外添丁酸使发酵底物更多的进入丁醇合成的代谢途径，减少了发酵体系副产物如乙酸、丁酸的生成，大大提高了丁醇产量，强化了发酵液中丁醇所占的比例。丁酸及缓冲剂两种物质同时选择在对数期添加，既能刺激细菌发酵活性又能稳定发酵体系的pH不至于发生酸崩溃现象。本发明专利技术不仅提高了丁醇最终产量，还大大提高了丁醇合成速率，在能源和环境领域有重要意义。

A method for improving the activity of butanol produced by anaerobic bacteria

A method for improving the butanol production activity of anaerobic bacteria, which solves the problems of high substrate cost, low butanol production efficiency and excessive by-product content in the existing butanol production technology. When butanol bacteria are fermented into logarithmic phase, a certain concentration of butyric acid solution and buffer agent are added, and then the mixture is evenly mixed and then oscillating culture is carried out under constant temperature condition to obtain fermentation broth rich in butanol. The present invention added to butyric acid fermentation substrate into the metabolic pathway of butanol synthesis more, reducing the production of fermentation system byproducts such as acetic acid and butyric acid, greatly improve the butanol yield enhanced, butanol fermentation liquid proportion. Butyric acid and buffer two substances simultaneously selected in logarithmic phase, not only can stimulate bacterial fermentation activity, but also can stabilize the fermentation system of pH without acid collapse phenomenon. The invention not only improves the final yield of butanol, but also greatly improves the synthesis rate of butanol, and has great significance in the fields of energy and environment.

【技术实现步骤摘要】
一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法
本专利技术属于微生物发酵生产清洁能源
，具体涉及到一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法。
技术介绍
化石能源的逐年开采和利用，使全球范围内化石能源存储量日益降低，且石油价格的不断增长，造成能源形势异常严峻，环境问题愈演愈烈。随着人口的飞速增长，社会经济的迅猛发展，世界能源需求量日益提高。在能源枯竭和环境恶化的双重压力下，世界各国俱在积极发展可再生和绿色能源来替代传统的化石能源。生物能源是可替代化石燃料的重要清洁能源。丁醇是一种极具潜力的新型生物燃料，与当前流行的生物燃料添加剂乙醇相比，具有热值高于乙醇、低吸湿性、低蒸汽压、不易溶于水、更容易与汽油和柴油燃料相混合等优点。虽然生物丁醇有良好的工业前景，但在丁醇发酵过程中由于丁醇的低产量，低合成速率使其生产力受到严重限制，导致工业化进程缓慢。为了使丁醇发酵在工业生产上更具有竞争力，必须提高丁醇的生产能力，这也是目前国内外发酵法生产丁醇的研究热点和难点。丁醇发酵是一个复杂的生物反应过程，在发酵过程中受细胞浓度、产物抑制等因素的影响。为了解决丁醇发酵所面临的上述问题，国内外研究者通过研究新的发酵工艺来提高丙酮-丁醇发酵的生产能力，如使用细胞回流和固定化细胞技术来提高细胞浓度和反应器的效率，以及通过萃取发酵来减弱产物抑制。近年来，随着生物技术的飞速发展，采用分子生物学手段、基因改造技术以及代谢工程来增加丙酮丁醇梭菌发酵丁醇的产量得到了广泛关注。虽然基因改造是最有前途的操作技术，但由于丁醇发酵途径的复杂性，并且发酵过程中基因控制复杂，且不易操作，导致基因工程领域进展缓慢。目前为止，尚没有基因工程菌能适合工业化生产。丁醇发酵代谢过程已阐明分为产酸期和产溶剂期两个阶段。在发酵初期，随着发酵的进行，产生大量丁酸和乙酸，发酵液pH值迅速下降，称为产酸期。当酸性物质积累到一定浓度，pH降到一定值时发酵液的还原倾向增强，乙酸、丁酸等被还原成丙酮、丁醇等新的产物，从而使pH升高，进入产溶剂期。丁醇，丙酮等溶剂的产生是碳代谢由产酸途径向产溶剂途径的转变，而丁酸作为合成丁醇的必需和有效的前体物质，通过向培养基中添加丁酸或许可作为菌体由产酸期向产溶剂期转化的诱导因子，快速激活产丁醇的代谢途径，促进丁醇合成。另外，在发酵产酸期由于大量有机酸积累，在这个过程中，如果不进行pH值的调节，那么极有可能会导致酸崩溃现象，从而使发酵受抑制而使产率降低。因此，研究简单、有效的诱导因子丁酸的添加方式及pH的调控策略对促进丁醇合成，提高丁醇转化效率具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术不足，而提出的一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法，关键在于诱导因子丁酸的添加方式及稳定pH的调控策略，为了解决上述问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术的一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法，它是按照以下步骤进行的：一、将产丁醇细菌接种到已灭菌的液体厌氧发酵培养基中，在恒温条件下振荡培养至对数期；二、待步骤一中细菌生长达到对数期后，将丁酸溶液添加到步骤一发酵体系中，使发酵体系中的丁酸溶液浓度达到0.6～1.5g/L；三、在添加完丁酸溶液后，将缓冲剂间歇添加到步骤二中所建立的发酵体系中，恒温条件下继续振荡培养，得到以丁醇为主的发酵液，即完成所述的提高厌氧细菌产丁醇活性；所述的缓冲剂添加总量为0.03～0.04mol/L，间歇添加的条件为每间隔24h添加一次，共添加2次，每次添加后振荡均匀。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)丁酸是合成丁醇的前体物质，添加少量丁酸有助于激发丁醇的合成的代谢途径，促进丁醇的快速合成，缩短发酵周期。(2)本专利技术丁酸添加时间选择在菌体生长的对数期，可以避免其对菌体的生长造成消极的影响，还可以避免酸崩溃发生。(3)本专利技术在加入丁酸后立即添加缓冲剂能够在后期丁醇发酵过程中中和有机酸，提升培养基的缓冲能力，维持一个比较稳定的pH，减轻环境对于产丁醇细菌的胁迫，有效的避免了酸崩溃现象发生。(4)本专利技术中的缓冲剂是以间歇添加的手段加入的，能够更加精准的持续缓冲pH。避免一次性大量添加导致pH快速升高，从而延缓发酵体系由产酸期向产溶剂期的的转变(5)本专利技术使发酵底物更多的进入丁醇合成的代谢途径，减少了发酵体系副产物如乙酸、丁酸的生成，大大提高了发酵液中丁醇所占的比例。通过与对照试验进行比较分析，丁醇最终产量与对照相比提高了139.4％，丁醇最大合成速率与对照组相比提高了168.3％。因此，本专利技术根据代谢支路耦联的特性，提出通过添加丁醇代谢过程前体物质丁酸来激发丁醇的快速合成，并开发了通过间歇流加缓冲剂的调控策略控制发酵体系pH，使丁醇发酵能够高效、稳定运行。该专利技术具有性能稳定、运行效果好、工艺操作简便等优势，便于推广应用。附图说明图1为具有代表性的后述的实例的微生物发酵制丁醇产量图；其中，A为添加丁酸+碳酸钙的丁醇产量曲线，B为对照曲线；图2为具有代表性的后述的实例的微生物发酵制丁醇合成速率图；其中，A为添加丁酸+碳酸钙的丁醇产量曲线，B为对照曲线。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式的一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法，它是按照以下步骤进行的：一、将产丁醇细菌接种到已灭菌的液体厌氧发酵培养基中，在恒温条件下振荡培养至对数期；二、待步骤一中细菌生长达到对数期后，将丁酸溶液添加到步骤一发酵体系中，使发酵体系中的丁酸溶液浓度达到0.6～1.5g/L；三、在添加完丁酸溶液后，将缓冲剂间歇添加到步骤二中所建立的发酵体系中，恒温条件下继续振荡培养，得到以丁醇为主的发酵液，即完成所述的提高厌氧细菌产丁醇活性；所述的缓冲剂添加总量为0.03～0.04mol/L，间歇添加的条件为每间隔24h添加一次，共添加2次，每次添加后振荡均匀。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的液体厌氧发酵培养基含有浓度为40～60g/L的碳源、1～3g/L酵母提取物、0.1～0.3g/L硫酸镁、0.01～0.02g/L硫酸锰、0.01～0.02g/L硫酸亚铁、0.01～0.02g/L氯化钠、0.001～0.002g/L维生素B1、0.3～0.7g/L半胱氨酸、0.001～0.002g/L对氨基苯甲酸、0.0001g/L生物素和0.1～0.2g/L刃天青。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的液体厌氧发酵培养基含有浓度为40～60g/L的碳源、2g/L酵母提取物、0.2g/L硫酸镁、0.01g/L硫酸锰、0.01g/L硫酸亚铁、0.01g/L氯化钠、0.001g/L维生素B1、0.5g/L半胱氨酸、0.001g/L对氨基苯甲酸、0.0001g/L生物素和0.1g/L刃天青。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的液体厌氧发酵培养基中的碳源可为葡萄糖、淀粉或木质纤维素物质水解糖化液。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的产丁醇细菌为严格厌氧菌。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的严格厌氧菌包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、丁酸梭菌以及通过基因工程改造的微生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、将产丁醇细菌接种到已灭菌的液体厌氧发酵培养基中，在恒温条件下振荡培养至对数期；二、待步骤一中细菌生长达到对数期后，将丁酸溶液添加到步骤一发酵体系中，使发酵体系中的丁酸溶液浓度达到0.6～1.5g/L；三、在添加完丁酸溶液后，将缓冲剂间歇添加到步骤二中所建立的发酵体系中，恒温条件下继续振荡培养，得到以丁醇为主的发酵液，即完成所述的提高厌氧细菌产丁醇活性；所述的缓冲剂添加总量为0.03～0.04mol/L，间歇添加的条件为每间隔24h添加一次，共添加2次，每次添加后振荡均匀。

【技术特征摘要】
1.一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、将产丁醇细菌接种到已灭菌的液体厌氧发酵培养基中，在恒温条件下振荡培养至对数期；二、待步骤一中细菌生长达到对数期后，将丁酸溶液添加到步骤一发酵体系中，使发酵体系中的丁酸溶液浓度达到0.6～1.5g/L；三、在添加完丁酸溶液后，将缓冲剂间歇添加到步骤二中所建立的发酵体系中，恒温条件下继续振荡培养，得到以丁醇为主的发酵液，即完成所述的提高厌氧细菌产丁醇活性；所述的缓冲剂添加总量为0.03～0.04mol/L，间歇添加的条件为每间隔24h添加一次，共添加2次，每次添加后振荡均匀。2.根据权利要求1所述的一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法，其特征在于步骤一中所述的液体厌氧发酵培养基含有浓度为40～60g/L的碳源、1～3g/L酵母提取物、0.1～0.3g/L硫酸镁、0.01～0.02g/L硫酸锰、0.01～0.02g/L硫酸亚铁、0.01～0.02g/L氯化钠、0.001～0.002g/L维生素B1、0.3～0.7g/L半胱氨酸、0.001～0.002g/L对氨基苯甲酸、0.0001g/L生物素和0.1～0.2g/L刃天青。3.根据权利要求2所述的一种提高厌氧细菌产丁醇活性的方法，其特征在于步骤一中所述的液体厌氧发酵培养基含有浓度为40～60g/L的碳源、2g/L酵母提取物、0.2g/L硫酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹广丽，圣亚春，武继文，赵磊，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23