一种突变型A型DNA聚合酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，公开了一种突变型A型DNA聚合酶及其编码基因和应用，所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生。本发明专利技术提供了一种与未经改造突变的A型DNA聚合酶相比具有增强的dUTP掺入速度的突变型A型DNA聚合酶，其掺入dUTP的效果明显好于对照A型DNA聚合酶，因此更加适用于一些用dUTP取代dTTP的核酸扩增体系中，使该体系在防止核酸扩增产物污染的同时又不损失目的产物的扩增效率，从而满足食品、动物检疫、人类疾病筛查等多重PCR领域、法医领域及科研应用需求。

Mutant A type DNA polymerase and its coding gene and Application

The present invention relates to the field of molecular biology and discloses a mutant type A DNA polymerase and its encoding gene and application, the conservative motif A mutation type DNA polymerase by A DNA polymerase in dNTP binding domain mutation have occurred. The invention provides a method and unmodified mutation type A DNA polymerase compared with enhanced dUTP incorporation rate of mutant type A DNA polymerase, the doping effect of dUTP was better than that of the control type A DNA polymerase, so it is more suitable for some dUTP to replace dTTP nucleic acid amplification system, the the system in the prevention of amplification efficiency of nucleic acid amplification products and pollution and loss of product, so as to meet the food, animal quarantine, human disease screening of multiple PCR, forensic field and scientific research applications.

【技术实现步骤摘要】
一种突变型A型DNA聚合酶及其编码基因和应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种突变型A型DNA聚合酶及其编码基因和应用。
技术介绍
DNA聚合酶是以核苷酸链为模板在有镁离子的情况下通过形成新的‘3-5’磷酸二酯键将dNTP掺入到新合成的核苷酸链中，从而复制DNA。在体内，DNA聚合酶参与包括DNA的复制，DNA的修复等复杂的反应。在体外，通过PCR(聚合酶链式反应)技术，DNA聚合酶可以大量合成DNA。DNA聚合酶作为DNA生命的最基本的酶促反应，随着生命的进化而进化。所有的DNA聚合酶家族都有一个共同的双二价离子催化中心，但在其他结构上则有较大的差别。不考虑这些DNA聚合酶构象上的明显差异，所有的聚合酶结构在组成上都可以看做是一个“右手”的结构。这个结构包括“Thumb”“palm”“fingers”三个结构域。其中，palm结构域最为保守，这里有聚合酶的催化中心区域。除了高度保守以外，DNA聚合酶的活性部位也被证明是相对易变的，能够容纳某些氨基酸置换而不显著降低DNA聚合酶活性。这些突变型DNA聚合酶可以改善DNA聚合酶的某些性能，例如提高保真性、抗盐能力等，从而满足工业和研究应用中的不同需求。在扩增实验室，最常见的污染物是核酸扩增产物的污染，造成核酸扩增产物污染的形式最可能是气溶胶污染，核酸扩增反应体系在开盖、摇动、吸样过程中与空气接触形成气溶胶，造成严重的核酸扩增产物污染现象。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳使实验结果判断为假阳性。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题[AvoidingfalsepositiveswithPCR-Nature1989Jun8；339(6224):490.]。为了防止核酸扩增产物的污染，避免PCR结果的假阳性，专利US5035996提出了dUTP取代dTTP的核酸扩增体系，这样的核酸扩增体系扩增后的核酸扩增产物都是含有dU的DNA链。在下次PCR扩增开始前，体系中加入尿嘧啶糖基化酶(简称UNG酶)，其可降解核酸链中的尿嘧啶碱基，但不降解反应体系中游离的dUTP，并增加50℃的保温步骤，UNG酶即可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下DNA链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。随后UNG酶被灭活，不会再降解新扩增的产物U-DNA。这一体系被广泛地应用于诊断试剂中，并起到了较好的效果。目前这个体系存在的问题是，当用dUTP取代dTTP时，野生型TaqDNA聚合酶对dUTP的掺入速率要比dTTP低很多，导致目的产物的扩增效率较低，因此需要把dUTP加入量提高2到3倍来提高TaqDNA聚合酶对目的产物的扩增效率(例如：dATP：dGTP：dCTP：dUTP＝1：1：1：2和dATP：dGTP：dCTP：dUTP＝1：1：1：3)。当游离镁离子浓度低的时候，野生型TaqDNA聚合酶的这个问题尤其严重。因此，在用dUTP代替dTTP进行核酸扩增的体系中，野生型TaqDNA聚合酶结构上的缺陷，使其在此应用领域受到限制。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种突变型A型DNA聚合酶，使得该突变型A型DNA聚合酶在dUTP取代dTTP的核酸扩增体系中，能够具备更高的对dUTP的掺入效率，从而实现更佳的扩增效果，同时保证突变型A型DNA聚合酶的活力和热稳定性与野生型A型DNA聚合酶无显著差异。本专利技术的另外一个目的在于提供上述突变型A型DNA聚合酶的编码基因以及重组载体、宿主细胞。本专利技术的另外一个目的在于提供所述突变型A型DNA聚合酶在核酸扩增中的相关应用，如生产核酸扩增试剂盒、进行核酸扩增等。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种突变型A型DNA聚合酶，所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生。现有技术虽然有对DNA聚合酶进行突变的方案，但是突变后的效果多是体现在聚合酶的保真度、抗抑制性和扩增速度等方面，针对dUTP取代dTTP的核酸扩增体系的dUTP掺入效率较差的问题，目前还未有相关的研究报道。本专利技术在已有的A型DNA聚合酶基础上(包括野生型和突变型)进行特殊的氨基酸位点突变，获得了相应的突变型A型DNA聚合酶，提高了dUTP掺入效率。作为优选，所述保守motif选自A型DNA聚合酶第656-667位氨基酸位点。进一步优选地，所述保守motif选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点。其中，所述A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点为除T以外的任意氨基酸；更进一步地，所述A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点为T、M、I、L、P之外的任意氨基酸；在本专利技术具体实施方式中，所述A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点为R、K、Q或V。作为优选，所述保守motif在选自A型DNA聚合酶第656-667位氨基酸位点基础上，还包括选自A型DNA聚合酶第500-514位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第736-762位氨基酸位点。其中，A型DNA聚合酶第500-514位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第736-762位氨基酸位点可具体为A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点。在本专利技术具体实施方式中，所述A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点为K，所述A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点为K。本专利技术所述A型DNA聚合酶指具备如下特征的一列DNA聚合酶：由Thumb(拇指区)、palm(手掌区)、fingers(手指区)三个结构域组成，具有N端的5’核酸外切酶区，以及位于C端聚合区与N端5’核酸外切酶区之间的3’核酸外切酶区。以TaqDNA聚合酶为例简单说明，其结构上属于A型DNA聚合酶。TaqDNA聚合酶的聚合酶区与所有的A型DNA聚合酶都有相同的结构特征，其形状就像人的右手一样，由拇指区、手掌区和手指区组成。掌心区的功能是催化磷酰基转移反应，手指区的功能则是促进三磷酸核苷酸与模板配对，拇指区控制双链DNA的位置移动和子链延伸。TaqDNA聚合酶与其他A型DNA聚合酶一样具有N端的5’核酸外切酶区，以及位于C端聚合区与N端5’核酸外切酶区之间的3’核酸外切酶区。本专利技术适合于所有A型DNA聚合酶，特别是来源于嗜热细菌(thermophilicbacteria)的野生型或天然存在的聚合酶；或通过对所述来源于嗜热细菌(thermophilicbacteria)的野生型或天然存在的聚合酶进行氨基酸置换、插入、缺失或其它修饰衍生出的聚合酶；或与所述来源于嗜热细菌(thermophilicbacteria)的野生型或天然存在的聚合酶具备至少60％、70％、80％、90％、95％或更多氨基酸同一性的聚合酶。而在这其中，优选为热稳定的A型DNA聚合酶。其中，所述嗜热细菌(thermophilicbacteria)选自海栖热袍菌(Thermotogamaritima)、水生嗜热杆菌(Thermusaquaticus)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、黄栖热本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生。

【技术特征摘要】
1.一种突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生。2.根据权利要求1所述突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述保守motif选自A型DNA聚合酶第656-667位氨基酸位点。3.根据权利要求2所述突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述保守motif选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点。4.根据权利要求3所述突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点为除T以外的任意氨基酸。5.根据权利要求4所述突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点为T、M、I、L、P之外的任意氨基酸。6.根据权利要求5所述突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点为R、K、Q或V。7.根据权利要求2所述突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述保守motif在选自A型DNA聚合酶第656-667位氨基酸位点基础上，还包括选自A型DNA聚合酶第500-514位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第736-762位氨基酸位点。8.根据权利要求7所述突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述保守motif在选自A型DNA聚合酶第656-667位氨基酸位点基础上，还包括选自A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点。9.根据权利要求8所述突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点为K。10.根据权利要求8所述突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点为K。11.根据权利要求1所述突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述A型DNA聚合酶为来源于嗜热细菌(thermophilicbacteria)的野生型或天然存在的聚合酶；或通过对所述来源于嗜热细菌(thermophilicbacteria)的野生型或天然存在的聚合酶进行氨基酸置换、插入、缺失或其它修饰衍生出的聚合酶；或与所述来源于嗜热细菌(thermophilicbacteri...

【专利技术属性】
技术研发人员：何文龙，毕万里，王志清，陈剑峰，刘连弟，
申请(专利权)人：苏州新海生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32