一种检测与量化人促卵泡激素体外生物学活性的同源竞争酶联免疫分析法制造技术

本发明专利技术提供了一种人促卵泡激素同源竞争酶联免疫分析方法来检测与量化促卵泡激素药物或相关促卵泡激素样品的体外生物学活性。本发明专利技术是一种利用抗原‑‑抗体免疫亲和性来检测、量化和反映人促卵泡激素体外生物学活性的分析方法。本发明专利技术与临床上化学发光免疫分析法检测人促卵泡激素的效果相比，其易于操作，生产成本较低，能同时检测多个样品浓度，并在一定范围内根据酶标仪检测的吸光值可直接反映出测试的人促卵泡激素的体外生物学活性。本发明专利技术所检测的曲线范围宽广，且标品或样品稀释梯度符合线性规律(直接采用倍比稀释)。此外检测灵敏度虽然以IU/ml为单位，实质性达到了以mIU/ml为单位计算促卵泡激素体外生物学活性。

A competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection and quantification of biological activity of human follicle stimulating hormone in vitro

The present invention provides a human follicle stimulating hormone homologous competitive enzyme-linked immunosorbent assay to detect and quantify the biological activity of a follicle stimulating hormone drug or a related follicle stimulating hormone sample in vitro. The present invention is a method of using antibody antigen affinity to detect, quantify and reflect human follicle stimulating hormone in vitro biological activity analysis method. Chemiluminescence immunoassay for human follicle stimulating hormone effect compared with the clinical, easy operation, low production cost, can simultaneously detect multiple sample concentration, and in a certain range according to the microplate absorbance value can directly reflect the test by the in vitro biological activity of follicle hormone the. The range of the curve detected by this method is wide, and the dilution gradient of the sample or sample conforms to the linear rule (directly using the ratio dilution). In addition, the sensitivity of the assay was calculated to be IU/ml, which substantially reached the biological activity of follicle stimulating hormone (mIU/ml) in vitro.

【技术实现步骤摘要】
一种检测与量化人促卵泡激素体外生物学活性的同源竞争酶联免疫分析法
本专利技术涉及生物医药工程与
，特别是涉及一种用于检测与量化人促卵泡激素药物体外生物活性的同源竞争酶联免疫分析法。
技术介绍
促卵泡激素(FSH)是垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种由两个亚基通过非共价键结合形成的异源二聚体糖蛋白类促性腺激素。它与人类某些疾病(如不孕不育、绝经后乳腺癌、卵巢癌等)密切相关，常用于临床辅助治疗用药。以及其具有较高的社会经济价值，广泛的应用在畜牧业(如牛羊)、水产业(如渔业)等领域。当前，有两类商业化的促卵泡生长激素药物产品均可在市场上获得：一类是尿源促卵泡激素(uFSH),主要是从绝经妇女尿液中提取纯化获得，如瑞士Serono公司的TERTINEX/METRODIN(1986)，Ferring公司的BRAVELLE(2002)，以及我国丽珠集团的丽申宝(2010)。另一类是重组促卵泡激素(rFSH),主要是利用基因工程技术和细胞培养工艺来制备重组促卵泡激素生物制品，如瑞士Serono公司的GONAL-F(1995)、GONAL-FRFF(2004)和GONAL-FRFFPEN(2004),以及荷兰Organon公司的PUREGON(1996)、FOLLISTIMAQ(2004)和ELONVA(2010)。近几年来，随着市场需求的增加，迫切需要长效、安全的尿源或重组促卵泡激素药物新品来供应。然而，该种激素产品在上市之前，需要进行严格的临床试验，尤其是体内外生物活性的鉴定与评估。目前，体外有效、快速的检测与量化促卵泡生长激素免疫技术仅有少数被报道。酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种用于检测与量化抗体或抗原的方法和广泛应用在生物医学领域里的一种重要的诊断和分析工具。根据其检测的方式不同，可以分为双抗夹心ELISA，间接ELISA和竞争ELISA等。同源竞争酶联免疫分析法(同源竞争ELISA)起源于1997年专利技术的条纹鲈黄体生成素ELISA，随后应用到欧洲黑鲈促卵泡激素的检测与量化。这种检测和量化的方式具有较高的灵敏性、精准性和特异性，以及可再现性。基于上述鱼类激素同源竞争酶联免疫的特点和指南，我们进一步建立了一种新型的检测与量化人促卵泡激素的同源竞争酶联免疫分析方法。这种分析方法与临床上电化学发光免疫分析法检测人促卵泡激素的效果相比，易于操作，生产成本较低，能同时检测多个样品，并在一定范围内可直接根据酶标仪检测的吸光值反映出人促卵泡激素药物或相关促卵泡激素样品的体外生物学活性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种人促卵泡激素同源竞争酶联免疫分析方法来检测与量化促卵泡激素药物或相关促卵泡激素样品的体外生物学活性。为了实现本专利技术的技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种利用抗原--抗体免疫亲和性来检测、量化和反映人促卵泡激素体外生物学活性的分析方法。其中抗原来源于商业化的重组人促卵泡激素(果纳芬，5.5ug(75IU)，MerckSerono公司；国药准字S20130055)和尿源促卵泡激素(丽申宝，75IU，中国丽珠集团；国药准字H20052130)；抗体来源于商业化的单克隆anti–FSHα抗体(Abcam公司；商品目录号ab9500)和羊抗鼠-HRP抗体(康为世纪公司；商品目录号CW0102S)；封闭试剂来源于商业化的脱脂奶粉(美国BD公司；商品目录号232100)、胎牛血清(WISENT公司；商品目录号086150)、牛血清白蛋白(Sigma公司；商品目录号V900933)和正常羊血清(JACKSON公司；商品目录号005000121)。人促卵泡激素同源竞争酶联免疫分析法含有以下步骤。(1)抗原包被：96孔酶标板(Corning公司；商品型号2592)中包被60ul/well尿源促卵泡激素(丽申宝)溶液(1IU/mlor1000IU/L)，放置4℃冰箱过夜。同时在同一酶标板中用磷酸盐缓冲液PBS(PH7.2-7.4)分别包被5孔作非特异性结合组【接受anti–FSHα抗体稀释液和羊抗鼠-HRP抗体稀释液】和4孔作空白对照组【仅接受羊抗鼠-HRP抗体稀释液】【这两组的作用是检测封闭试剂的封闭效果和酶标板是否每次清洗干净】(2)封闭：第二天，用PBS包含0.05％Tween-20(PBST)清洗酶标板3次，每次60-90秒。随后可以采用以下4种任意一种封闭方式进行封闭：a)5％的脱脂奶粉【用电子天平称量1g脱脂奶粉溶于20ml去离子水中，并用玻璃棒充分搅拌均匀】(320ul/well)封闭,37℃避光孵育2.5h；b)PBST包含3％的胎牛血清(FBS)【用移液枪取0.6ml胎牛血清溶于19.4mlPBST中并充分搅拌均匀】(320ul/well)封闭，37℃避光孵育1h；c)PBST包含2％的牛血清蛋白(BSA)【用电子天平称量0.4g牛血清白蛋白溶于20mlPBST溶液中，并用玻璃棒充分搅拌均匀】封闭(320ul/well)，37℃避光孵育1h；d)PBS包含2.5％的正常羊血清【根据说明书先将冻干粉末态的正常羊血清溶于10ml无菌去离子水配成储备母液，再将储备母液用PBST溶液稀释成2.5％工作液】(NGS)(320ul/well)封闭，37℃避光孵育1h。(3)孵育一抗：在分配到封闭好的酶标板前，50ul尿源促卵泡激素标品(丽申宝)、50ul重组促卵泡激素(果纳芬)和50ul其他促卵泡激素供试样品分别预先与50ul的单克隆anti–FSHα抗体稀释液【用移液枪取1ul的anti–FSHα抗体加入到装有12mlPBS的离心管(15ml)中充分混匀，即一抗初始稀释按1：12000进行稀释。待与标品或供试样品等体积添加到同一小离心管(1.5ml)中后，即标品或供试样品浓度再次稀释了2倍，一抗最终稀释比例为1:24000】(最终稀释浓度为1：24000)在1.5ml离心管中，放置4℃冰箱孵育过夜。尿源促卵泡激素(丽申宝)既是作包被抗原也作促卵泡激素标品，标准曲线检测范围设置在0.015-1.98IU/ml。随后分别将100ulanti–FSHα抗体与尿源促卵泡激素混合液、100ulanti–FSHα抗体与重组促卵泡激素混合液、100ulanti–FSHα抗体与其他促卵泡激素样品混合液加入到用PBST清洗3次的封闭好的酶标板中，放置4℃冰箱无震荡孵育48h。最大吸光值(B0)和非特异性结合(NBS)只接受100ul单克隆anti–FSHα抗体最终稀释溶液(1:24000)【一抗初始稀释液(1:1200)与PBS溶液在小离心管(1.5ml)等体积混合】，空白对照组直接添加PBS溶液。(4)孵育酶标二抗；用PBST清洗酶标板5次，每次60-90秒。清洗完后每孔添加100ul羊抗鼠-HRP抗体稀释液(用PBS稀释，1:3000)【羊抗鼠-HRP酶标二抗按1:3000用PBS溶液稀释成工作液】，37℃避光孵育40min。(5)颜色反应:用PBST清洗酶标板5次，每次60-90秒。清洗完后每孔添加100ulTMB显色液(索莱宝公司；商品目录号PR1210)，37℃避光孵育8-10min，随后添加2M50ul/well的硫酸终止反应。使用酶标仪(ThermoLabsystemMK-3)在450nm读取吸光值。(6)原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测与量化人促卵泡激素体外生物学活性的同源竞争酶联免疫分析法，其特征在于：包括以下步骤：(1)抗原包被：96孔酶标板中包被60ul/well尿源促卵泡激素(丽申宝)溶液(1IU/ml or 1000IU/L)，放置4℃冰箱过夜；同时在同一酶标板中用磷酸盐缓冲液PBS(PH7.2‑7.4)分别包被5孔作非特异性结合组和4孔作空白对照组；(2)封闭：第二天，用PBS包含0.05％Tween‑20(PBST)清洗酶标板3次，每次60‑90秒，随后可以采用以下4种任意一种封闭方式进行封闭：a)5％的脱脂奶粉(320ul/well)封闭,37℃避光孵育2.5h；b)PBST包含3％的胎牛血清(FBS)(320ul/well)封闭，37℃避光孵育1h；c)PBST包含2％的牛血清蛋白(BSA)封闭(320ul/well)，37℃避光孵育1h；d)PBS包含2.5％的正常羊血清(NGS)(320ul/well)封闭，37℃避光孵育1h；(3)孵育一抗：在分配到封闭好的酶标板前，50ul尿源促卵泡激素标品(丽申宝)、50ul重组促卵泡激素(果纳芬)和50ul其他促卵泡激素供试样品分别预先与50ul的单克隆anti–FSHα抗体稀释液(最终稀释浓度为1：24000)在1.5ml离心管中，放置4℃冰箱孵育过夜；尿源促卵泡激素(丽申宝)既是作包被抗原也作促卵泡激素标品，标准曲线检测范围设置在0.015‑1.98IU/ml。随后分别将100ul anti–FSHα抗体与尿源促卵泡激素混合液、100ul anti–FSHα抗体与重组促卵泡激素混合液、100ul anti–FSHα抗体与其他促卵泡激素样品混合液加入到用PBST清洗3次的封闭好的酶标板中，放置4℃冰箱无震荡孵育48h；最大吸光值(B0)和非特异性结合(NBS)只接受100ul单克隆anti–FSHα抗体最终稀释溶液(1:24000)，空白对照组直接添加PBS溶液；(4)孵育酶标二抗：用PBST清洗酶标板5次，每次60‑90秒，清洗完后每孔添加100ul羊抗鼠‑HRP抗体稀释液(用PBS稀释，1:3000)，37℃避光孵育40min；(5)颜色反应:用PBST清洗酶标板5次，每次60‑90秒，清洗完后每孔添加100ul TMB显色液，37℃避光孵育8‑10min，随后添加2M 50ul/well的硫酸终止反应，使用酶标仪(Thermo Labsystem MK‑3)在450nm读取吸光值；(6)原始数据处理:将原始数据导入Excel软件初步处理，随后利用GraphPad Prism 5软件进一步处理，以标品和供试样品的浓度为横坐标，对应的450nm下吸光比值(Bi/Bo)为纵坐标，绘制标准曲线和供试样品的剂量‑反应曲线，同时利用Origin pro 8软件进行拟合线性回归分析。...

【技术特征摘要】
1.一种检测与量化人促卵泡激素体外生物学活性的同源竞争酶联免疫分析法，其特征在于：包括以下步骤：(1)抗原包被：96孔酶标板中包被60ul/well尿源促卵泡激素(丽申宝)溶液(1IU/mlor1000IU/L)，放置4℃冰箱过夜；同时在同一酶标板中用磷酸盐缓冲液PBS(PH7.2-7.4)分别包被5孔作非特异性结合组和4孔作空白对照组；(2)封闭：第二天，用PBS包含0.05％Tween-20(PBST)清洗酶标板3次，每次60-90秒，随后可以采用以下4种任意一种封闭方式进行封闭：a)5％的脱脂奶粉(320ul/well)封闭,37℃避光孵育2.5h；b)PBST包含3％的胎牛血清(FBS)(320ul/well)封闭，37℃避光孵育1h；c)PBST包含2％的牛血清蛋白(BSA)封闭(320ul/well)，37℃避光孵育1h；d)PBS包含2.5％的正常羊血清(NGS)(320ul/well)封闭，37℃避光孵育1h；(3)孵育一抗：在分配到封闭好的酶标板前，50ul尿源促卵泡激素标品(丽申宝)、50ul重组促卵泡激素(果纳芬)和50ul其他促卵泡激素供试样品分别预先与50ul的单克隆anti–FSHα抗体稀释液(最终稀释浓度为1：24000)在1.5ml离心管中，放置4℃冰箱孵育过夜；尿源促卵泡激素(丽申宝)既是作包被抗原也作促卵泡激素标品，标准曲线检测范围设置在0.015-1.98IU/ml。随后分别将100ulanti–FSHα抗体与尿源促卵泡激素混合液、100ulanti–FSHα抗体与重组促卵泡激素混合液、100ulanti–FSHα抗体与其他促卵泡激素样品混合液加入到用PBST清洗3次的封闭好的酶标板中，放置4℃冰箱无震荡孵育48h；最大吸光值(B0)和非特异性结合(NBS)只接受100ul单克隆anti–FSHα抗体最终稀释溶液(1:24000)，空白对照组直接添加PBS溶液；(4)孵育酶标二抗：用PBST清洗酶标板5次，每次60-90秒，清洗完后每孔添加100ul羊抗鼠-HRP抗体稀释液(用PBS稀释，1:3000)，37℃避光孵育40min；(5)颜色反应:用PBST清洗酶标板5次，每次60-90秒，清洗完后每孔添加100ulTMB显色液，37℃避光孵育8-10min，随后添加2M50ul/well的硫酸终止反应，使用酶标仪(ThermoLabsystemMK-3)在450nm读取吸光值；(6)原始数据处理:将原始数据导入Excel软件初步处理，随后利用GraphPadPrism5软件进一步处理，以标品和供试样品的浓度为横坐标，对应的450nm下吸光比值(Bi/Bo)为纵坐标，绘制标准曲线和供试样品的剂量-反应曲线，同时利用Originpro8软件进行拟合线性回归分析。2.如权利要求1所述的一种检测与量化人促卵泡激素体外生物学活性的同源竞争酶联免疫分析法，其特征在于：步骤(1)中丽申宝(75IU)最初用无菌蒸馏水(250ul)稀释为300IU/ml储备母液,并-20℃储存备用；用时将储备母液用PBS(PH7.2-7.4)稀释为1IU/ml。3.如权利要求1所述的一种检测与量化人促卵泡激素体外生物学活性的同源竞争酶联免疫分析法，其特征在于：步骤(3)中先将稀释好的标品或样品用移液枪移入小离心管中，随后再加入稀释好的anti–FSHα抗体溶液(1:12000)，切记不要混匀，放置4℃冰箱孵育过夜即可，此步骤与包被抗原同步进行；添加抗体-标品或样品混合液时，用移液枪混匀后再加入到封闭好的酶标...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾斌，胡建文，刘华，韩继忠，刘梦梦，孙云龙，
申请(专利权)人：江西科技师范大学，
类型：发明
国别省市：江西,36